海洋メタン生成菌Methanothermococcus Thermolithotrophicusにおける同化的硫酸塩還元

Nature Microbiology (2023)この記事を引用

39 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Methanothermococcus Thermolithotrophicus は、硫酸塩を唯一の硫黄源として増殖する既知の唯一のメタン生成菌であり、メタン生成と硫酸塩の還元を独自に結び付けています。今回我々は、生理学的、生化学的、構造的分析を用いて、このメタン生成古細菌の完全な硫酸塩還元経路のスナップショットを提供します。私たちは、この経路の後の段階が非定型の酵素によって触媒されることを発見しました。 APS キナーゼによって放出された PAPS (3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸) は、異化性硫酸還元の APS レダクターゼと同様の PAPS レダクターゼによって亜硫酸塩と 3'-ホスホアデノシン 5'-リン酸 (PAP) に変換されます。次に、非標準的な PAP ホスファターゼが PAP を加水分解します。最後に、F420 依存性亜硫酸還元酵素は、細胞同化のために亜硫酸塩を硫化物に変換します。メタゲノムおよびメタトランスクリプトームの研究は、硫酸塩還元経路がいくつかのメタン生成菌に存在することを示唆していますが、M. サーモリソトロフィカスの硫酸同化経路は別のものです。私たちは、この経路が他の微生物から同化酵素と異化酵素を獲得することによって「混合」され、その後独自の代謝役割を果たすために再利用されたと提案します。

最も一般的なメタン生成微生物は、その特有の酵素と代謝により硫黄を多く要求します。これらのメタン生成菌のほとんどは硫化物 (HS-) を使用しますが、一部のメタン生成菌は硫黄を獲得するためにより高い酸化状態の硫黄、さらには金属硫化物 (FeS2 など) を代謝することが示されています 1,2,3,4,5。しかし、Methanothermococcus Thermolithotrophicus は、硫酸塩 (\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)) を唯一の硫黄源として増殖できる唯一の既知のメタン生成菌です4,6。ナポリ (イタリア) 近郊の地熱で加熱された海底堆積物から分離されたこの海洋水素栄養生物の代謝は逆説的です。\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の減少により、いくつかの影響が生じるはずです。メタン生成微生物に対する生理学的障害。まず、メタン生成菌は一般に、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を含め、CO2 以外のすべての電子受容体が枯渇した還元硫化物環境で繁殖します (参考文献 7、8)。第二に、メタン生成菌と \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) イオンが共存する界面では、水素栄養性メタン生成菌は異化性 \({{\rm{SO}}} と競合する必要があります)共通基質二水素 (H2) の _{4}^{2-}\) 還元微生物 9。第三に、メタン生成菌は生命の熱力学的限界で生息しており、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の削減と組み合わせたアデノシン三リン酸 (ATP) の加水分解は、そのような生物にとってかなりの投資となるでしょう。エネルギーが限られた微生物8,10。最後に、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元経路は、細胞プロセスを妨害する有毒な中間体を生成します。

\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を同化するには、生物は陰イオンを捕捉し、トランスポーターを使用して細胞内に輸送する必要があります。細胞内では、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) が ATP スルフリラーゼ (ATPS) によって活性化され、アデノシン 5'-ホスホ硫酸 (APS) が生成されます 11,12,13 。そこから、生物はさまざまな戦略を使用できます (拡張データ図 1、ルート a ～ c): (1a) APS は APS レダクターゼ (APSR) によって直接還元され、AMP と \({{\rm{SO}}} が生成されます) _{3}^{2-}\)。 (1b) あるいは、APS は、APS キナーゼ (APSK) によってさらにリン酸化されて 3'-ホスホアデノシン 5'-ホスホ硫酸 (PAPS) になります。 PAPS レダクターゼ (PAPSR) は、PAPS を \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) と有毒ヌクレオチド 3'-ホスホアデノシン 5'-リン酸 (PAP) に還元します。 PAP は、PAP ホスファターゼ (PAPP) によって迅速に AMP と無機リン酸塩に加水分解されなければなりません。どちらのシナリオでも、最終ステップはシロヘム含有亜硫酸還元酵素によって実行され、\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) を HS- に還元します。後者はバイオマスに組み込むことができます。 (1c) 別の経路では、PAPS の亜硫酸塩基が別の受容体に転移して硫酸化代謝物が蓄積されます。ルート 1a は、異化経路 (拡張データ図 1、ルート 2) に非常に似ています。しかし、異化性 APSR と異化性亜硫酸レダクターゼは、同化性の対応物とは構造的および系統発生的に異なり、それらの反応を間接的に膜ポンプに結び付け、エネルギーの節約を可能にします 14、15、16。

\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の減少に関連すると推定される酵素をコードする遺伝子が、M. サーモリソトロフィカスを含む複数のメタン生成菌 13 のゲノムで発見されています。このメタン生成菌については、不完全ではあるものの、理論的には \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化経路が仮説として立てられます。ここでは、この古細菌の完全な \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元機構を解明し、この 1 つのメタン生成菌がどのように \({{\rm{SO}} を変換できるか) を説明します。 }_{4}^{2-}\) を人生の基本ブロックに組み込みます。

Na2S上で増殖させた培養物を、増殖が観察されなくなるまで連続的に無硫黄培地に移した。 M. サーモリソトロフィカスは、少なくとも 100 μM の Na2SO4 が培地に補充された場合に強力な増殖を示し、Na2S で増殖させた培養物と同様の細胞収量に達しました。これらの培養条件下では、細胞密度が増加するにつれて \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) が時間の経過とともに消費されます（図 1a）。細胞がNa2S上でのみ増殖した場合、 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) は検出されませんでした（図1a）。これは、M.サーモリソトロフィカスが硫化物酸化を行っていないことを示しています。

a、Na2S (黒色の四角、0.5 mM) および Na2SO4 (灰色の四角、0.5 mM) 上で増殖させた M. サーモリソトロフィカスの培養物。 Na2S 培養物または Na2SO4 培養物における \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の消費または放出は、それぞれ黒い三角形と灰色の三角形で示されています。データは平均値 ± SD として表示され、個々の値は球体として表示されます (n = 3 反復)。初期点の予想濃度 (0.5 mM) と測定濃度 (0.13 mM) の差 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) は、初期点からのアーティファクトによるものと考えられます。中 (「メソッド」を参照)。 b、3 つの独立した発酵槽で 10 mM Na2SO4 上で増殖させた M. サーモリソトロフィカス。サンプリング点は灰色の四角で表されます。 c、モリブデン酸塩（Na2MoO4）によるNa2SO4同化性古細菌および異化性古細菌の阻害。 M. サーモリソトロフィカスの増殖実験は 2 回行い、A. fulgidus の増殖実験は 4 回 (左) または 3 回 (右) で行いました。データは平均として表され、三重および四重の±sd d、M の全ゲノムショットガン配列からの \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 減少の予測オペロン. サーモリソトロフィカス。

ソースデータ

次に、バッチ条件から発酵槽条件に切り替えて、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で培養した培養物に挑戦しました。発酵槽条件では、H2S が気相に逃げることができ、他の培養物に比べて蓄積しません。フラスコの状態に合わせます。温度とpHが制御されたこの開放系では、M.サーモリソトロフィカスは19時間以内に最大光学密度（OD）600nmの6.45まで増殖しました（図1b）。

M. サーモリソトロフィカスが \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元経路の標準酵素に依存しているかどうかを判断する 1 つの方法は、モリブデン酸塩 (\({{\rm{ MoO}}}_{4}^{2-}\))。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の構造類似体は ATPS に結合してモリブデン分解を引き起こし、ATP を AMP とピロリン酸 (PPi) に加水分解し、細胞エネルギーの枯渇を引き起こします 17 、18． \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) モル比 0.004 :1 は異化性 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元細菌の活性を 168 時間阻害するのに十分であり、この効果は主に ATPS によるモリブデン分解によるものです19,20。 21. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の同化は \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) の影響も受けます。植物に関する研究によって証明されている22。後者では、\({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) が \({{\rm{SO}}}_{4} と比較して過剰な場合に成長阻害が発生しました) ^{2-}\)、ATPS 活性は 1:1 の比率で顕著に影響を受けました 18。 M. サーモリソトロフィカスに適用した場合、12.5:1 という高い \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):Na2S 比は Na2S 培養物の増殖を妨げず、\ ({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) は基礎代謝を妨げません。対照的に、 \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の比率6.25:1 の比率は \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で増殖させた培養物に対して阻害的でしたが、1:1 の比率は阻害しませんでした (図 1c および拡張データ図.2a)。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 阻害された文化に \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) が加わる成長が回復しました（拡張データ図 2b）。これは、阻害の可逆性と \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) 濃度ではなく、{SO}}}_{4}^{2-}\) 比です。比較すると、エネルギーを節約するために異化的な \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元を行う古細菌である Archaeoglobus fulgidus では、\({{\) で成長阻害が観察されました。 rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 比率 0.001:1 (図 1c および拡張データ図 2c)。これらの結果は、M. サーモリソトロフィカスが機能的 ATPS を含む同化経路を介して \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を減少させることを示唆しています。推定上のスタンドアロンATPSおよびAPSKをコードする遺伝子は、確かに、我々が再配列決定したDSM2095株のゲノム内の同じ遺伝子座上にあった（図1d）（参考文献13、23）。それらの機能を確認するために、M. サーモリソトロフィカス由来の ATPS および APSK (それぞれ、MtATPS および MtAPSK) の特性をさらに調べました。

組換え発現されたMtATPSおよびMtAPSKの活性は、共役アッセイ（図2aおよび補足図1）によってテストされ、0.070±0.004μmolの酸化NADH min-1 mg-1のMtATPSの比活性が測定されました。これらの条件下では、律速段階はピロホスファターゼ活性でした。これは、他のATPS24で以前に示されたようなレトロ阻害を回避するために、急速なピロリン酸分解（図2a）の必要性を強調しています。 \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の比率: 1: 1.25 では活性が半分に減少しました (「方法」を参照)。これは、他のホモログで示されているように、ATPS が \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) とも反応していることを裏付けています 18,21。

a、上のパネル、MtATPSおよびMtAPSKによって触媒される反応。下のパネルは、共役酵素アッセイによって測定されたMtATPSおよびMtAPSKの比活性。「-」は、示された反応物質が存在しないことを示します。データは平均±標準偏差として示され、個々の値は灰色の球として示されます (n = 3 反復)。 b、MtATPSホモ二量体構造。一方のモノマーは薄黄色の表面で示され、もう一方のモノマーは漫画で示されています。 c、シアン色のカーボンを備えたボールとスティックとして示されるAPSを含むThermus Thermophilus HB8（PDB：1V47、灰色）からのATPSに重ねられたMtATPS（黄色）の活性部位。基質結合に関与する残基は棒で強調表示され、MtATPS からの残基のみが標識されています。 T. サーモフィラス由来のATPSとAPSの間の水素結合は破線で表されます。窒素、酸素、リン、硫黄はそれぞれ青、赤、オレンジ、黄色に着色されています。 d, ATPS ホモログ間の配列保存。 e、MtAPSK ホモ二量体構造。1 つのモノマーは明るいオレンジ色の表面で示され、もう 1 つは漫画で示されています。破線で示された柔軟なループはモデル化できませんでした。すべての構造において、N 末端と C 末端はそれぞれ青と赤の球で示されています。 f、APSK ホモログ間の配列保存。 d と f では、赤い太字の残基は基質の結合に関与しており、赤い星と黒い星はそれぞれ完全によく保存された残基です。

ソースデータ

MtATPS の構造は 1.97 Å の分解能まで精密化され、APS と \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) との共結晶化にもかかわらず、アポ状態で得られました (拡張データ表 1) ）。結晶パッキングは 2 つの結晶形のホモ二量体集合を示唆していますが、サイズ排除クロマトグラフィーと PISA を使用した表面分析 (www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/) により、細菌ホモログと同様のホモ二量体状態が確認されました (拡張データ図 3a および図 3a)。補足図2)。この構造は、3つのドメイン（ドメインI、1〜156、ドメインII、164〜314、およびドメインIII、320〜382、図2b）を含む典型的なATPSフォールドを示します。二量体界面は、T.サーモフィルスで観察されるように主にドメインIIIによって組織されており、これは他の構造ホモログと比較して顕著な違いです（拡張データ図3a、b）（参考文献25、26、27）。多くの好熱性細菌や古細菌と同様に、ドメイン III には、熱安定性に寄与する可能性のある亜鉛結合ドメイン (320-343; 拡張データ図 3c、d) が含まれています 27。 MtATPS と構造相同体を重ね合わせると、おそらく基質が存在しないため、わずかなドメインの再配置が示されます (拡張データ図 3b)。反応に重要なすべての残基はMtATPSで保存されており、保存された反応メカニズムが主張されています（図2c、d、拡張データ図3e、f、4a、および補足図3）。

M. サーモリソトロフィカスの APS キナーゼモデル、MtAPSK は 1.77 Å まで改良されました。 MtAPSK は細菌の酵素に非常によく似た組織を持つホモ二量体を形成しますが、これはその高度な配列保存により予想されました (拡張データ図 4b および 5a)。共結晶化と結晶のAPSおよびMgCl2への浸漬にもかかわらず、ATP β-リン酸の予想される位置に結合リン酸を有するアポ状態でMtAPSK構造が得られました（図2eおよび拡張データ図5b、c）。 N 末端と領域 125 ～ 152 (後者は基質結合に関与します 28,29) は、電子密度が欠如しているためモデル化できませんでした。ただし、基質とMg2+に結合する残基は保存されており（図2f、拡張データ図5b、c、補足図4）、共役酵素アッセイで確認されたように、MtAPSKが機能するはずであることを示唆しています。

ATPS と APSK が活性化すると、代謝経路 1b または 1c をたどる中間体である PAPS が生成されます (拡張データ図 1)。どちらの経路も、硫酸転移酵素とエキソリボヌクレアーゼを阻害し、RNA 異化作用を妨害する有毒生成物 PAP の生成につながります 30,31。したがって、PAP ホスファターゼによって効率的に加水分解される必要があります。ゲノムには関連するPAPホスファターゼは含まれていませんでしたが、ATPSおよびAPSK遺伝子を含むゲノム環境で推定上のホスホエステラーゼをコードする遺伝子（図1d）が見つかりました。 DHHファミリーに属するこのPAPホスファターゼ候補は、組換えにより発現され、PAPから無機リン酸（Pi）を速い速度で生成した（50.2±5.9μmolのPiが、マンガンを含む精製酵素のmin-1mg-1で放出された）。この活性はマンガンの添加により刺激され、PAP に対して高い特異性を示しました (図 3a)。

a、上のパネル、MtPAPPによって触媒される反応。下のパネル、Pi の生成を介して決定された MtPAPP の比活性 (左) およびさまざまなヌクレオチドに対する相対酵素活性 (右)。データは平均±標準偏差として示され、個々の値は灰色の球として示されます (n = 3 反復)。 b、漫画で示したMtPAPPの組織。 N 末端と C 末端は、それぞれ青と赤のボールとして強調表示されます。 AMP の炭素、窒素、酸素、リンは、それぞれシアン、青、赤、オレンジに色付けされます。 c、MtPAPPの活性部位の拡大図。 AMP および Mn2+ イオンを配位する残基は棒で強調表示され、b のように色付けされています。DHH モチーフの残基はピンク色に色付けされています。 d、表面表現で示され、168の古細菌ホモログにわたる配列保存によって色分けされたMtPAPP構造の断面図。カラーグラデーションの範囲は、可変 (ティール) から保存 (マゼンタ) までです。 e. 二次構造の表現は ESPript 3.0 を使用して行われました (参考文献 61)。色付きの枠はさまざまなドメインに対応しています: DHH ドメインは薄緑色、リンカーは灰色、DHHA1 ドメインは濃い緑色です。 168 の古細菌相同体にわたる完全かつよく保存された残基は、それぞれ赤と黄色で強調表示されます。 MtPAPP を構成する二次構造は標識されており、β シート、α ヘリックス、β ターンはそれぞれ矢印、スプリング、太字の TT として強調表示されています。

ソースデータ

この非標準的な PAP ホスファターゼ (MtPAPP と命名) の機構を解明するために、この酵素をマンガンおよび PAP と共結晶化しました。 AlphaFold2（参考文献32、33）によって生成されたテンプレートによる分子置換によって解明された構造は、3.1Åの分解能まで精密化され、部分的に占有されたMn2+としてモデル化された活性部位に生成物AMPとイオンが含まれていました（拡張データ表） 1)。 MtPAPP 配列は、DHH ファミリーに属するホモログ (DHH モチーフを除く) とは一致しませんが、エキソヌクレアーゼ RecJ または枯草菌由来のオリゴリボヌクレアーゼ NrnA (BsNrnA、PAP ホスファターゼ活性も示す) と同様の全体的なフォールドを共有しています。拡張データ図 6a) (参考文献 34、35、36)。このモノマーは、リンカー領域（残基181～210）によって相互接続されたN末端ドメイン（DHH、残基1～180）とC末端ドメイン（DHHA1、残基211～315）で構成され、中央の溝を形成しています（図1）。 3b)。 DHHドメインには触媒部位が含まれており、DHHA1ドメインは高い特異性で基質に結合する足場として機能します（図3b、cおよび拡張データ図6b）。 RecJ および BsNrnA の Mn2+ イオンを配位するモチーフは MtPAPP34,36 に完全に保存されているため、活性状態では MtPAPP に 2 つの Mn2+ が負荷されると予想されます。最初のものは、構造内で部分的に観察され、4 つのアスパラギン酸塩 (Asp8、Asp10、Asp57、Asp127) と His6 との長距離相互作用によって配位されています。存在しない 2 番目の Mn2+ は、Asp10、Asp57、Asp127、DHH モチーフ (His76、His77)、および水分子によって配位されると考えられます (拡張データ図 6c)。 AMPは構造相同体（β9β10β11）と同様の局在を共有していますが、タンパク質との異なる相互作用によって結合しています（拡張データ図6bおよび補足図5）。ヌクレオチド結合部位は、酵素が閉じた状態にある場合、理想的には PAP の 3'-リン酸をマンガンの前に配置します (拡張データ図 6c)。リンカーによって可能になるドメイン間の移動により、基質/生成物の迅速な交換が促進され、MtPAPP の代謝回転が増加します。このPAPホスファターゼの完全な配列は、ヌクレオチド結合部位が保存されている168個の古細菌のゲノムで見つかりました（図3d、eおよび補足図6）。これは、古細菌にPAPを解毒する共通の酵素があることを示唆しています（拡張データ図7a）。

標準的な PAPS レダクターゼ (ルート 1b) またはスルホトランスフェラーゼ (ルート 1c) をコードする遺伝子は、M. サーモリソトロフィカスのゲノムには見つかりませんでした。ただし、異化性APSレダクターゼとして注釈が付けられた遺伝子（αおよびβサブユニット、APSR;拡張データ図7bおよび補足図7）が存在し、以前に記載された遺伝子と共起します（図1d）。

このAPSレダクターゼ様酵素の活性と基質特異性を実験的に確認するために、両方のサブユニットを大腸菌で共発現させ、精製し、酵素活性アッセイで試験しました（図4a）。 APS から AMP および \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) への可逆的還元を触媒する異化的 APSR とは対照的に (参考文献 37、38)、逆反応 (つまり、AMP と \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)、または PAP と \({{\rm{SO}}}_{3}^)電子受容体として K3Fe(CN)6 を使用することにより、M. サーモリソトロフィカス酵素の {2-}\) を基質として使用します。代わりに、共役酵素アッセイを使用して、in vitro で経路を再構成しました (拡張データ図 8)。 MtATPS、ピロホスファターゼ、および MtAPSK を使用して PAPS を生成し、MtPAPP を添加して反応の潜在的なレトロ阻害剤である PAP を除去しました 39。活性は、還元メチルビオロゲン (MVred) の酸化によってモニタリングされました。すべての成分が存在する場合、APS レダクターゼ様酵素の酸化 MV min-1 mg-1 の 0.114 ± 0.007 μmol の比酵素活性が測定されました。 5 倍過剰の APS レダクターゼ様酵素により、比酵素活性が 220% 増加し、この酵素が反応の律速段階であることが示されました (拡張データ図 8c)。しかし、PAP の蓄積 (MtPAPP または Mn2+ の除去によって誘導される) は、その活性を強く阻害しました。基質としてAPSを用いた比酵素活性（つまり、MtAPSKの除去）は、APSレダクターゼ様酵素の酸化MV min-1 mg-1 0.007 ± 0.001 μmolでした（図4a）。この共役酵素アッセイの複雑さを考慮すると、反応速度パラメータを決定することはできませんでした。しかし、このアッセイにより基質特異性に関する洞察が得られ、M. サーモリソトロフィカス由来の APS レダクターゼ様酵素が PAPS レダクターゼの特性を示すことが確認されました。

a、上のパネル、MtPAPSRによって触媒される反応。下のパネル、共役酵素アッセイによって測定されたMtPAPSRの相対酵素活性（拡張データ図8）。データは平均±標準偏差として示され、個々の値は灰色の球として示されます (n = 3 反復)。 b、1 つのヘテロ二量体を表面に示し、もう 1 つを漫画で示した MtPAPSR 組織。両方のサブユニットの N 末端と C 末端はボールとして示され、それぞれ青と赤で色付けされています。ヘテロ二量体パートナーはプライムで標識されます。炭素、窒素、酸素、リン、鉄、硫黄はそれぞれレモン、青、赤、オレンジ、茶色、黄色に着色されています。 c、補因子と電子の流れの拡大図。 [4Fe-4S] クラスターとそれらを調整するシステイン、電子伝達に関与すると提案されている FAD および Trp42 が棒と球で示され、b のように色付けされています。 d、e、APS（AfAPSR、PDB：2FJA）および人工的にモデル化されたPAPS（e）を含むA. fulgidusを含むA. fulgidusからのAPSR（d）の活性部位（e）は透明な表面で示されています。基質認識に関与する残基 (モデル化された PAPS に基づく) はボールとスティックの形で示され、b のように色付けされます。赤い矢印は PAPS が衝突する場所を示しています。 f、MtPAPSR、AfAPSR、メガロデスルホビブリオギガス (DgAPSR、PDB: 3GYX) および Caldanaerobius fijiensis 由来の推定 APSR (CfAPSR、WP_073344903) のアルファサブユニットにわたる配列の保存。MtPAPSR と 68% の配列同一性を共有します。 APSRに対するAPS結合に関与する残基は太字で赤色で示されている。完全に保存された残基はそれぞれ赤と黒の星で強調表示されます。 Trp206 と Tyr207 は FAD 結合に関与します。配列アライメントはMUSCLE62を用いて行われた。

ソースデータ

M. サーモリソトロフィカス由来の型破りな APS レダクターゼ様酵素についてさらに分子上の洞察を得るために、酵素を嫌気条件下で結晶化しました。この構造は、Fe K エッジで測定された単一波長異常分散実験によって解析され、1.45 Å の分解能まで精密化されました (拡張データ表 1)。この複合体は、異化性APSレダクターゼと同じ集合体を有するα2β2ヘテロ四量体として組織化されます（図4bおよび拡張データ図9）。しかし、それは、チオレドキシン/グルタチオン依存性である、特徴付けられた単一ドメイン同化性 APS/PAPS レダクターゼとは大きく異なります。同化性APS/PAPSレダクターゼは、M.サーモリソトロフィカス酵素と配列や構造的相同性を共有しておらず、同化性APS/PAPSレダクターゼの基質結合と触媒活性を媒介すると提案されているいくつかのモチーフが存在しない（拡張データ図9）（参考文献40））。

M. サーモリソトロフィカスでは、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD) を含む α サブユニットはフマル酸還元酵素ファミリーのメンバーであり 37,41,42、β サブユニットは主に 2 つの [4Fe-4S] が結合したフェレドキシン様ドメインで構成されています。 ]クラスターは8つのシステイン残基によって配位されています（図4c）。 M. サーモリソトロフィカス酵素に対する同化性 P/APS レダクターゼの相同体はありませんが、A. fulgidus 由来の異化性 APS レダクターゼの α サブユニットと 38% の配列同一性を共有します (AfAPSR PDB: 2FJA、437 Cα の rmsd は 1.02 Å 整列) αサブユニット上）。 APSを配位する残基は異化性ファミリーでは不変であるが、M.サーモリソトロフィカスでは異なり、APSからPAPSへの特異性の切り替えを引き起こす可能性がある。 PAPでの短い浸漬にもかかわらず、推定上の基質ポケットには溶媒のみが含まれており、AfAPSRを使用して酵素の活性部位のPAPSを人工的にモデル化しました（図4d、e）。主にループ104〜123によってもたらされるさまざまな置換は、塩橋相互作用と水素結合によって追加の3'-リン酸基を収容します（図4d〜f）。しかし、APS レダクターゼでは、保存されたグルタミン (A. fulgidus のα145) がこのリン酸基と衝突します。異化性APSレダクターゼで提案されている触媒残基は、M.サーモリソトロフィカスの酵素に保持されています（拡張データ図9および補足図7）。したがって、我々は、硫黄 PAPS に対する FAD 原子 N5 の求核攻撃に基づいた同一の反応機構を提案します。これにより、PAP と FAD-\({{\rm{SO}}} に崩壊する FAD-PAPS 中間体が生成されます)。 _{3}^{2-}\) (参考文献 37、42)。酵素速度と構造解析を総合すると、M. サーモリソトロフィカスは、PAPS を \({{\rm{SO}}}_{3}^{2- }\) と PAP。

MtPAPSR によって生成された \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) はさらに HS- に還元される必要があります。水素栄養性メタン生成菌では、\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) がメタン生成機構に損傷を与えるため、F420 依存性亜硫酸還元酵素 (Fsr) によって解毒されなければなりません 23,43。我々は以前にM.サーモリソトロフィカス（MtFsr）のグループI Fsrを同定および特徴付けし、\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)に対する強力な酵素活性を決定した（参考文献23）。 2 番目の Fsr アイソフォームのほかに、M. サーモリソトロフィカスには、他の潜在的な亜硫酸レダクターゼが含まれていません。質量分析により、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で増殖させた細胞から単離された Fsr が特徴付けられたグループ I の MtFsr であることが確認されましたが、2 番目の Fsr アイソフォームの生理学的役割は依然として残っています。不明23. したがって、MtFsr は \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) の HS− への最終還元を触媒する最良の候補です。異なる硫黄基質上で増殖させた培養物の細胞抽出物を用いたネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ネイティブ PAGE) により、Na2S 上で増殖させた細胞には MtFsr が存在せず、\({{\rm{SO}}}_{3) 上で増殖させた細胞には MtFsr が豊富に存在することが確認されました。 }^{2-}\) (参考文献 23,43)。

Na2SO3 増殖細胞からの細胞抽出物の酸化 MV min-1 mg-1 の 7.31 ± 0.63 μmol と比較して、Na2SO3 増殖細胞からの細胞抽出物の酸化 MV min-1 mg-1 の比亜硫酸レダクターゼ活性は 18.42 ± 0.13 μmol であると測定しました。 Na2SO4増殖細胞では、Na2S増殖培養物からの細胞抽出物は、3.04±0.25μmolの酸化MV min-1 mg-1の比亜硫酸レダクターゼ活性を有していた（図5a）。一致して、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で増殖させた培養物のネイティブ PAGE で Fsr と互換性のあるバンドが観察されましたが、その量は \({ {\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) 条件 (図 5b)。私たちのグループが最近発表した MtFsr 構造は、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で増殖させた細胞から得られたもので、\( {{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) 条件23. 総合すると、これらの結果は、MtFsrが\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)還元経路の最後の酵素として使用されることを主張します（図5c）。

a、異なる硫黄源で増殖させたM.サーモリソトロフィカスからの細胞抽出物における亜硫酸レダクターゼ活性。データは平均±標準偏差として示され、個々の値は灰色の球として示されます（n = 3の生物学的に独立した反復）。 b、異なる硫黄源で増殖させたM.サーモリソトロフィカス細胞抽出物を含むhrCNゲル（サンプルあたり15μgのタンパク質をロード、n = 2の生物学的に独立した二重）。 c、M.サーモリソトロフィカスにおける提案された\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)同化経路。黄色と灰色の背景は、それぞれ \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元経路とメタン生成経路を強調表示します。太い矢印は高い代謝フラックスを示します。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化経路を操作する酵素の構造は、リガンドを球と棒として表面表現で示しています。酵素は次のように略記されます。Fwd/Fmd、ホルミルメタノフランデヒドロゲナーゼ。 Ftr、テトラヒドロメタノプテリン (H4MPT) ホルミルトランスフェラーゼ。 Mch、メテニル-H4MPT シクロヒドロラーゼ。 Mtd、メチレン-H4MPT デヒドロゲナーゼ。 Mer、5,10-メチレン-H4MPT レダクターゼ。 Mtr、N5-CH3-H4MPT: コエンザイム M メチルトランスフェラーゼ。 Mcr、メチル補酵素 M レダクターゼ。 ADK、アデニル酸キナーゼ。 Frh、F420 還元 [NiFe]-ヒドロゲナーゼ。 Eha/Ehb、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ。 DASS/SUIP クラスに属する推定 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) トランスポーターは、WP_018154444/WP_018154062 およびピロホスファターゼ WP_018154121 であると提案されています。

ソースデータ

メタン生成菌は一般に硫黄源として HS- を使用し、Fsr タイプ I を発現するメタン生成菌は \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) でも増殖できます (参考文献 13,23) ,43)。興味深いことに、一部のメタン生成菌は、完全または部分的な \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元経路のタンパク質をコードする遺伝子を持っています（補足図8）（参考文献13）。。では、なぜ M. サーモリソトロフィカスが \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で増殖することがこれまで証明されている唯一のメタン生成菌なのでしょうか? これをさらに調査するために、モデル生物として Methanocaldococcus infernus を使用しました。 M. infernus は海洋の超好熱菌で、M. thermolithtrophicus と非常によく似た生理機能を持ち、同じ培地で増殖できます。これには、記載された PAPSR を除く、この研究で特徴付けられた酵素をコードするすべての遺伝子が含まれています。しかし、M. infernusのゲノムは、推定上のチオレドキシン依存性PAPSRおよびAPSRをコードしており、生化学的に特徴付けられたM. jannaschiiの同化性APSRおよびPAPSRと高い配列同一性を共有している（図6aおよび拡張データ図7b）（参考文献44）。 ,45）。したがって、ゲノム情報に基づいて、M. infernus は \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を同化できるはずです。

a、Methanocaldococcus infernus は、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化経路全体を実行するゲノムの可能性を持っています。 WP_013099421はMtPAPPと59.68%のアミノ酸配列同一性を有し、WP_013099422はMtATPSと70.60%の配列同一性を有し、WP_157198836はMtAPSKと75.44%の配列同一性を有する。 APSR (WP_013100115) および PAPSR (WP_013099852) は、生化学的に特徴付けられた M. jannaschii 由来の APSR および PAPSR (それぞれ 68.64% および 58.35% のアミノ酸配列同一性) と類似しており、APS/PAPS を低下させることが示されています 44,45。 WP_013099852はMtPAPSRとは相同ではありませんが、M.サーモリソトロフィカスの推定PAPSレダクターゼであるWP_018154242とは相同です。 WP_013100746 は、グループ I MtFsr に対して 65.30% の配列同一性を持っています。ｂ、追加の硫黄源を含まない２ｍＭＮａ２Ｓ、２ｍＭＮａ２ＳＯ３、２ｍＭＮａ２ＳＯ４、または２ｍＭＮａ２Ｓを含む２ｍＭＮａ２ＳＯ４上でのＭ．サーモリソトロフィカスおよびＭ．インフェルナスの増殖。括弧内の \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) は、接種材料の硫黄基質として使用されたことを示します。培養物の最大OD600nmを三重反復で示し、平均±標準偏差として示す。硫黄、Na2SO4なしで、およびNa2SO4を含むNa2S上で増殖させたM.インフェルヌス培養物を二重に示す。各複製の個々のデータポイントは球として表示されます。

ソースデータ

M. サーモリソトロフィカスと M. インフェルナスは、M. サーモリソトロフィカスを 75 °C で維持し、M. サーモリソトロフィカス 65 °CM でインフェルナスを 2 mM Na2S および Na2SO3 で増殖させたが、 M.サーモリソトロフィカスとは対照的に、硫黄の唯一の供給源として\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)を使用します（図6b）。

このことから、メタン生成古細菌における \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化に関連する遺伝子の生理学的機能について疑問が生じます。私たちのデータに基づくと、他のメタン生成菌は依然として経路 1c を介して硫黄を取得するためにこれらの酵素を必要としている可能性があります (拡張データ図 1)。硫黄基は非標準的な硫酸転移酵素によってアクセプターに転移されると考えられ、これは未知の生合成経路にとって重要である可能性があります。これは、ATPS および APSK をコードする遺伝子も保有するメタン生成菌に、PAPP をコードする遺伝子が依然として存在する理由を説明できる可能性があります。この仮説に対する反論は、M. jannaschii で特徴付けられるチオレドキシン依存性 PAPSR または APSR の存在であり、むしろルート 1b を主張しています (参考文献 13、44、45)。この推定上の同化性APSRをコードする遺伝子がM.thermolithotrophicus(WP_018154242.1)にも存在することは注目に値する。したがって、メタン生成菌におけるこれらの酵素の生理学的役割を解明するには、さらなる生化学的研究が必要となるでしょう。

この研究は、メタン生成古細菌のユニークな \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化代謝を明らかにし、この経路に関与する酵素の完全なセットの分子スナップショットを提供しました。 M.サーモリソトロフィカスは、従来のATPSおよびAPSKによって\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)を活性化しますが、非標準的な酵素によってさらに変換します（図5c）。

APSK によって生成される PAPS は、通常、ホモオリゴマーとして組織化されたチオレドキシンまたはグルタチオン依存性の同化性 PAPS レダクターゼによって代謝されます。対照的に、MtPAPSR は異化性 APS レダクターゼからヘテロ四量体組織と FAD ベースの触媒機構を受け継いでいます (図 4、および拡張データ図 1 および 9)。私たちは、わずか数個のアミノ酸の置換によって特異性が PAPS に切り替わったと提案します（図 4d–f）。これは、同化 \({{\rm{SO}} を促進するための微調整された進化的適応の結果である可能性があります) }_{4}^{2-}\) の削減。活性部位（Ser122、Lys120、Arg121）でPAPSRの形質を与える残基をAPSRの残基と交換し、基質親和性への影響を観察することは価値があるだろう。

生成された PAP は、MtPAPP によって効率的に加水分解されます。この PAP ホスファターゼはホスホエステラーゼの DHH ファミリーに属し、エキソヌクレアーゼと構造的相同性を共有しますが、配列相同性はありません。比較すると、従来の PAP ホスファターゼ (FIG スーパーファミリーの一部) は異なるフォールド (つまり CysQ) を持ち、3 つのマグネシウムイオンを使用して PAP30 の 3'-リン酸を加水分解します。 MtPAPP は収斂進化の注目すべき例と思われ、古細菌が PAP を効率的に解毒するための独自の装置をどのように開発したかを示しています。

グループ I Fsr は、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元経路の最終ステップを触媒します。この酵素は、同化性亜硫酸レダクターゼの活性部位組成を備えた、異化性亜硫酸レダクターゼの異なる特性を示します23。 fsr 遺伝子を別の遺伝子座でコード化し、おそらくその発現の別の調節因子 (亜硫酸センサーなど) の下でコード化することで、メタン生成菌は \({{\rm{SO}}}_{3}^) を急速に脱共役させることができます。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 同化機構全体の発現による {2-}\) の解毒。 MtATPS、MtAPSK、およびMtPAPSRはかなり遅い触媒速度を示しますが（補足説明を参照）、MtFsrとMtPAPPは最初のステップと比較して高い比活性を有し、HS-生成に向けた平衡を引き起こし、有毒な中間体を効率的に除去します。私たちが提案した経路（図5c）では好ましい熱力学が可能ですが、不必要なATP加水分解を避けるために最初の反応を制御する必要があります。ホモログですでに示されているように、MtATPS、MtAPSK、およびMtPAPSRは、それら自体の生成物の蓄積によって相互制御されており、細胞内硫黄フラックスを調和させるための直接的なレトロ制御が可能になるのではないかと考えられます39、46、47。

M. サーモリソトロフィカスは生命の熱力学的限界で生きていますが、説明されている \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の同化には、1 つの処理に対して 3 つの ATP から ADP への加水分解が必要です \({ {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)。それにもかかわらず、自然条件下では、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を固定する利点により、エネルギー消費のバランスがとれると予想されます。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) で栽培された培養物は、追加のエネルギー要件によって妨げられることはありません。これは、高い一定の H2 を提供する培養条件によって説明できます。分圧。 H2 分圧が低く変動する環境条件下では、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) での増殖は、M. サーモリソトロフィカスにとってより困難になる可能性があります。メタン生成菌は ATP 投資を避けることはできませんが、PAPS から HS- への 8 電子還元反応のエネルギー節約戦略を見つけた可能性があります。 Fsr は F420H2 を酸化し、F420 還元ヒドロゲナーゼによって還元されます 23,48。 F420H2 または NAD(P)H は、MtPAPSR にとって有利な電子供与体となりますが、まだ同定されていないオキシダーゼパートナーの支援が必要となります。あるいは、独立型のMtPAPSRは還元型フェレドキシンに依存している可能性があり、これはEha/Ehb複合体を介したH2依存性フェレドキシン還元から得られる可能性があり、これは同化反応を促進するための還元力を提供する水素栄養生物の別の有利な戦略である（図5cで提案）（参考文献49）。

これまでのところ、メタン生成と HS- への完全な \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元の付随プロセスは M. Thermolithotrophicus に限定されているようです。驚くべきことに、M. サーモリソトロフィカスと \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元を実行するゲノム潜在能力を持つ他のメタン生成菌との唯一の明らかな違いは、PAPS レダクターゼの獲得です。これは異化ファミリーに属しているようです（補足図8、拡張データ図7b、および補足説明）。他のメタン生成菌におけるこれらの \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元関連遺伝子の生理学的機能や、\({ {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) M. サーモリソトロフィカス。生態学的観点から見ると、M. サーモリソトロフィカスの生存にとって、H2S の取り込みから \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}) に切り替えることができることは、必須ではないにしても有益である可能性があります。 \) 環境条件下での削減 (補足説明を参照)。

M. サーモリソトロフィカス \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元システムを、すでにガスコンバーターとして使用されているメタン生成宿主 (たとえば、メタンサーモバクター) に移植すると、安価で豊富な \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を使用することで、毒性が高く爆発性の高い H2S の必要性を回避します。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元性水素栄養性メタン生成菌は、より安全なバイオテクノロジー応用の素晴らしい可能性を開くだけでなく、メタン生成と硫酸塩還元の絡み合いの範囲についての疑問を強化します。初期古細菌の進化における経路。 M. サーモリソトロフィカスは、「組み合わせ」シナリオを通じて \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 削減経路全体を段階的に構築し、競争上の優位性を提供している可能性が最も高いです。硫黄源の状況が変動し、その生態的ニッチが拡大している。

M. サーモリソトロフィカス (DSM 2095)、M. インフェルヌス (DSM 11812) および A. フルギダス (DSM 4304) 細胞は、ライプニッツ研究所 DSMZ ドイツ微生物および細胞培養コレクション (ブラウンシュヴァイク、ドイツ) から入手しました。 M. サーモリソトロフィカスおよび M. インフェルヌスは、以前に記載された同じ最小培地でいくつかの変更を加えて培養されました 23 (培地の完全な組成については拡張データを参照)。

細胞増殖は、OD600 を測定することにより分光光度的に追跡されました。培養物の純度は光学顕微鏡でチェックした。メタン生成菌は、気相中で 80:20 の比率の 1 × 105 Pa の H2:CO2 を用いて培養されました。 M. インフェルナスは 250 ml ガラス血清フラスコ中で 75 °C で培養され、M. サーモリソトロフィカスはフラスコまたは発酵槽中で 65 °C で培養されました。血清フラスコは振らずに静置した。 A. fulgidus を、0.8 × 105 Pa N2:CO2 の嫌気性かつ密封された 22 ml Hungate チューブ内で培養しました。 DSM 4304培養物(0.5ml)を、最終濃度20mM d/l-乳酸を含む10mlの古典培地(培地組成の完全な組成については補足資料を参照)中で増殖させた。培養物を80℃で静置してインキュベートしました。すべての培養物は、嫌気条件下、暗所、室温で保存されました。 A. fulgidus 培地の場合、モリブデン酸塩濃度が高いと不安定になることがわかりました。 MoO42- 濃度が高いボトルの 1 つが黄色に変わり (O2 汚染とは無関係)、省略されたため、4 重ではなく 3 重の培養が行われました (図 1c、右パネル)。

２ｍＭＮａ２Ｓ上で増殖させたＭ．サーモリソトロフィカス細胞を、１０ｍｌの無硫黄培養培地に連続的に移した。 2 回の移植後、接種材料のキャリーオーバー硫黄濃度は M. サーモリソトロフィカスの増殖をサポートしませんでした。 2 mM Na2SO4 を補充することにより、M. サーモリソトロフィカスの増殖が再開されました。通常は適切な還元環境を確立するHS-の不在に対応するため、還元剤は添加されませんでした。再現性のためには、振とうせずにインキュベートすることが特に重要です。したがって、接種後、培養物を 65 °C で一晩静置し、続いて最大 OD600 に達するまで 180 回転/分 (rpm) で振盪してインキュベートしました。一晩インキュベートした後、気相をリフレッシュして、圧力を H2:CO2 の 1 × 105 Pa に維持しました。増殖を維持するために必要な最小 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 濃度を測定するには、硫黄制限された M. サーモリソトロフィカス細胞 (接種材料と培地の比率 1:20 を使用) ）には、2 mM、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、0.1 mM、および 0.04 mM Na2SO4 が提供されました。 0.1 mM で増殖させた細胞では増殖がまだ観察できましたが、0.04 mM Na2SO4 では観察できませんでした。

イオンクロマトグラフィー (Methrom イオンクロマトグラフ) を使用して \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 濃度を測定し、ソフトウェア IC MagIC Net 3.2 で分析しました。サンプルあたり 8 ml の容量が必要で、最大濃度は 0.5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) でした。したがって、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元 M. サーモリソトロフィカス細胞を、0.5 mM を添加した 100 ml の無硫黄培地を含む 1 l デュランボトルで増殖させました。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 予防接種前。陰性対照として、0.5 mM Na2S で増殖させた M. サーモリソトロフィカス細胞を \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元培養物と同様に使用し、接種して回収しました。すべてのサンプルは好気的に採取され、0.45 μM フィルター (Sartorius) に通されました。細胞密度が高すぎて濾過できない場合は、サンプルを 13,000 × g、4 °C で 7 分間遠心分離し、上清をイオンクロマトグラフィー測定用に採取しました。測定をすぐに実行しない場合、サンプルは 4 °C で保管されました。

M. サーモリソトロフィカスは、唯一の硫黄源として 10 mM Na2SO4 を使用し、3 つの独立した発酵槽で 60 °C で増殖させました。各発酵槽について、10 mM Na2SO4 を補充した 7 l の嫌気性培養培地 (メタノコッカス用の無硫黄培養培地を参照) を H2:CO2 (80:20、3 l min-1) で連続的にバブリングしました。撹拌（２２０ｒｐｍ）下で、培地に３６０ｍｌの前培養物（ＯＤ６００が３より高い）を接種した。接種の１時間後、培養物を８００ｒｐｍで撹拌し、酸性化の際にｐＨを再調整するための塩基としてＮａＯＨ（１Ｍ）を使用し、ｐＨプローブを使用して制御した。細胞を指数関数期後期（OD600 6.25 ～ 6.8）まで増殖させ、その後直ちに嫌気性テント（N2:CO2 雰囲気 90:10）に移しました。 4 °C、6,000 × g で 30 分間の嫌気性遠心分離によって細胞を収集しました。 SO42 成長発酵槽内で M. サーモリソトロフィカスについて記録された最高 OD600nm は、20 時間後に 6.8 でした。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) OD600 6.8 の培養液 (7 l) から、54 g の細胞 (湿重量) が得られました。細胞ペレットを密閉ボトルに移し、0.3 × 105 Pa N2 でガスを供給し、液体 N2 中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。

M. サーモリソトロフィカス由来の ATP スルフリラーゼ、APS キナーゼ、PAP ホスファターゼ、PAPS レダクターゼ α および β サブユニットの DNA 配列を大腸菌用にコドン最適化し、合成し、pET-28a(+) ベクターにクローニングしました。 MtATPS、MtAPSK、および MtPAPP では、制限部位 NdeI および BamHI を使用し、BamHI の前に終止コドン (TGA) を組み込みました。 MtPAPSRの場合、HisタグがαサブユニットのC末端に配置され、リボソーム結合部位がαサブユニットとβサブユニットのコード配列の間に挿入されました。 MtPAPSR構築物は制限部位NcoIおよびBamHIを有し、αサブユニットについてはHisタグの後に1つの終止コドンが組み込まれ、βサブユニットについてはBamHIの前に1つの終止コドンが組み込まれていた。これらの手順は GenScript (GenScript) によって実行されました。使用されるすべての配列は、「構築および遺伝子コドンの最適化」の補足情報に詳しく記載されています。

嫌気性雰囲気下で過剰発現および精製されたMtPAPSRを除き、同様のプロトコールに従って、すべての構築物を好気性条件下で過剰発現および精製した。すべての酵素を HisTrap 高性能カラム (GE Healthcare) に通し、必要に応じてタグの切断とゲル濾過を行いました (完全なプロトコールについては補足資料を参照)。

精製したMtATPS、MtAPSKおよびMtPAPPを、25 mM Tris/HCl pH 7.6、10% v/vグリセロール、2 mM ジチオスレイトールおよび150 mM NaCl中に保存しました。 MtPAPSR は、NaCl を含まない同じ緩衝液中に保存されました。新たに調製した非凍結サンプルを直ちに結晶化に使用しました。 MtATPS、MtAPSK、および MtPAPP 結晶は、18 °C の好気条件下で得られました。 MtPAPSR 結晶は、20 °C での最初のスクリーニングによって嫌気性 (N2:H2、ガス比 97:3) で得られました。シッティングドロップ法は、リザーバー内に90μlの結晶化溶液を含むポリスチレン(SWISSCI)中の96ウェルMRC 2ドロップ結晶化プレート上で実施した。

濃度 14 mg ml-1 (MtATPS フォーム 1、拡張データ表 1) または濃度 27 mg ml-1 (MtATPS フォーム 2) の MtATPS (0.7 μl) を 0.7 μl のリザーバー溶液と混合しました。 27 mg ml-1 の MtATPS を 2 mM AMPcPP および 2 mM Na2SO4 と共結晶化しました。 MtATPS フォーム 1 の場合、次の結晶化条件で数週間後に透明な星形結晶が現れました: 35% w/v ペンタエリスリトールエトキシレート (15/4 EO/OH) および 100 mM 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸 (MES) ）pH6.5。 MtATPS フォーム 2 の場合、次の結晶化条件: 20% w/v ポリエチレングリコール 8000、100 mM MES pH 6.0、および 200 mM 酢酸カルシウムで数週間後に、透明で長くて薄い板状の結晶が現れました。

17.6 mg ml-1 の濃度の MtAPSK (0.7 μl) を 0.7 μl のリザーバー溶液と混合し、2 mM MgCl2 で共結晶化させました。以下の結晶化条件：20% w/v ポリエチレングリコール 3350 および 100 mM クエン酸三ナトリウム pH 5.5 で数週間後に透明な板状結晶が現れました。 MtAPSK も 2 mM MgCl2 および 2 mM APS で結晶化されましたが、得られた結晶の構造は分解能が低く、活性部位に基質や生成物が存在しませんでした。

20 mg ml-1 の濃度の MtPAPSR (0.7 μl) を 0.7 μl のリザーバー溶液と混合し、FAD (最終濃度 0.5 mM) と共結晶化させました。位相調整に使用した結晶は茶色の平らな四角形で、次の結晶化条件: 40% v/v 2-メチル-2,4-ペンタンジオールおよび 100 mM トリス/HCl pH 8.0 で数日後に出現しました。

高解像度で精製した結晶は茶色で細長い板状でした。それは、以下の結晶化条件下で数日後に出現した: 35% v/v 2-メチル-2,4-ペンタンジオール、100 mM Tris pH 7.0、および 200 mM NaCl。液体 N2 に移す前に、結晶を 10 mM 3'-ホスホアデノシン 5'-リン酸二ナトリウムに 7 分間浸漬しました。

20 mg ml-1 の濃度の MtPAPP (0.7 μl) を 0.7 μl のリザーバー溶液と混合し、Tb-Xo4 (最終濃度 10 mM)、MnCl2 (最終濃度 2 mM) および 2 mM PAP で共結晶化させました。 Tb-Xo4 は核形成剤/位相調整剤 50 であり、結晶化性能を向上させるはずです。ただし、この場合、化合物の非存在下でも同じ結晶形が得られ、同様の解像度で回折されました。以下の結晶化条件: 1.6 M クエン酸三ナトリウムで数週間後に、透明な両錐形結晶が現れました。

MtPAPSR 結晶の取り扱いはコイテント内で嫌気性雰囲気 (N2:H2、97:3) で行われました。他の結晶は好気条件下で処理されました。結晶を液体窒素に直接浸すか、液体窒素で凍結する前に凍結保護剤を添加した結晶化溶液に 5 ～ 30 秒間浸漬しました。 MtATPS フォーム 2 では、30% グリセロールが凍結保護剤として使用されました。 MtAPSK の場合、25% エチレングリコールが凍結保護剤として使用されました。

結晶は、100 K の異なるシンクロトロンでテストおよび収集されました (拡張データ表 1)。 MtPAPP を除き、データは autoPROC51 で処理されました。MtPAPP では、X 線検出器ソフトウェア (XDS) によるインデックス付けと SCALA52 で実行されるスケーリングステップにより、より優れた統計が得られました。すべてのデータ収集統計は拡張データ表 1 に示されています。MtATPS フォーム 1 および 2、MtAPSK および MtPAPP は、PHENIX と次のテンプレートを使用して解決されました: MtATPS フォーム 1 の場合は 1V47 (T. サーモフィラス由来の ATPS)、MtATPS フォームの場合は MtATPS フォーム 1 MtAPSK の 2 および 5CB6 (Synechocystis sp. 由来の APS キナーゼ)。 MtPAPP の場合、テンプレートは AlphaFold 2 を使用して新たに作成されました (参考文献 32)。

MtPAPSR では、適切な波長でのデータ収集を最適化するために、Fe K エッジの X 線蛍光スペクトルが測定されました。単一波長異常分散実験のために、データセットは 1.73646 Å で収集されました。ネイティブデータセットは、別の結晶上で 0.97625 Å の波長で収集されました。データは autoPROC51 で処理およびスケーリングされました。位相調整、密度変更、自動構築は CRANK-2 を使用して実行されました (参考文献 53)。

すべてのモデルは COOT を使用して手動で再構築され、PHENIX54、55 でさらに洗練されました。改良中に、非結晶学的対称性と並進補正ねじが適用されました。 ATPS フォーム 1 を除くすべての構造では、最後の精製サイクルで乗車位置に水素が追加されました。最終的に堆積されたモデルでは水素が除去されました。

すべてのモデルは MolProbity56 を使用して検証されました。データ収集と改良統計、および堆積されたモデルと構造因子の PDB 識別コードが拡張データ表 1 にリストされています。図は PyMOL (Schrödinger) で生成されました。 MtATPS の金属は、CheckMyMetal57 を使用して亜鉛としてモデル化されました。

細胞を異なる硫黄源で増殖させたときの MtFsr の発現レベルを視覚化するために、hrCN PAGE を実行しました。 M. サーモリソトロフィカス培養物 (2 × 10 ml) に、硫黄基質として 2 mM Na2S、2 mM Na2SO3、2 mM Na2S と 2 mM Na2SO4、または 2 mM Na2SO4 のいずれかを補充し、65 °C で一晩静置して増殖させました。室温、6,000×gで20分間の嫌気的遠心分離によって細胞を収集し、細胞ペレットを2 mlの溶解緩衝液(50 mM トリシン pH 8.0および2 mM 亜ジチオン酸ナトリウム)に再懸濁した。細胞を70%強度で10秒間4回超音波処理し、その後30秒間休憩した(MS 73プローブ、SONOPULS Bandelin)。 hrCN PAGE は嫌気的に実行され、プロトコルは hrCN PAGE の準備の拡張データに詳しく記載されています。 1 つのゲルは 8 ～ 15% アクリルアミド勾配で実行され (図 5b を参照)、もう 1 つは 5 ～ 15% アクリルアミド勾配で実行されました (ソースデータ図 5 を参照)。

両方の酵素の活性は、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを介した NADH 酸化と共役する ADP の生成によって決定されました 58。アッセイは、最終容量 100 μl の 96 ウェルディープウェルプレートで実施し、35 ℃、360 nm で分光測光的にモニターしました (Omega マルチモードマイクロプレートリーダー)。１．５ｍＭＭｇＣｌ２および１００ｍＭＫＣｌを補充したｐＨ７．０のＫＨ２ＰＯ４（１００ｍＭ）を緩衝液として使用した。 NADH については、上記の条件でモル吸光係数 4,546.7 cm-1 M-1 が実験的に決定されました。バッファーに、1 mM NADH、2.5 mM Na2SO4、1 mM ホスホエノールピルビン酸 (PEP)、2 mM ATP、2 U 無機ピロホスファターゼ (Saccharomyces cerevisiae、10108987001、Sigma-Aldrich)、1.1 U ml-1 乳酸デヒドロゲナーゼ、0.8 U ml − 1 ピルビン酸キナーゼ (ウサギ筋肉、P0294、Sigma-Aldrich) および 0.5 mg ml-1 MtAPSK (すべて最終濃度) を添加しました。反応は、０．５ｍｇｍｌ－１ＭｔＡＴＰＳを添加することによって開始した。 0.02 mM Na2MoO4 の添加は活性に影響を与えませんでした（0.116 ± 0.027 μmol の酸化型 NADH min-1 mg-1）が、2 mM Na2MoO4 の添加により減少が生じました（0.068 ± 0.019 μmol の酸化型 NADH min-1 mg-1）。）。すべてのアッセイは 3 回繰り返して実行されました。

MtPAPP の活性はオルトリン酸の生成によって測定され、マラカイトグリーンリン酸アッセイキット (Sigma-Aldrich) を使用して緑色複合体の形成によって定量されました。アッセイは96ウェルディープウェルプレートで実施し、620nmでの吸光度を分光光度法で追跡した(Omegaマルチモードマイクロプレートリーダー)。ｐＨ７．６４のトリス／ＨＣｌ（２５ｍＭ）を緩衝液として使用した。緩衝液、40 μM PAP または 90 μM AMP/ADP/ATP/APS または PPi、1 mg ml-1 ウシ血清アルブミン、50 μM MnCl2 および/または 50 μM MgCl2 (最終濃度) を 1.5 ml エッペンドルフチューブ中で混合しました。氷。事前に凍結したMtPAPP (最終濃度0.5 μg ml-1)を加え、混合物(最終容量40 μl)を直ちに40℃で5分間インキュベートしました。次に、14 μl の反応混合物を 66 μl の濾過した Milli-Q H2O で希釈し、液体 N2 中ですぐに瞬間冷凍して反応を停止させました。次に、マラカイトグリーン試薬 20 μl をサンプルに添加し、混合物を室温で 30 分間インキュベートし、緑色複合体の形成を 620 nm で測定しました。すべてのアッセイは 3 回繰り返して実行されました。図 3a に示されている測定値は、2 つの異なる実験 (左と右のサブパネル) から得られています。両方の実験は、同じ酵素調製物を使用して 2 つの異なる日に実行されました。

PAPS は高温では不安定であるため、APS 生成のための異化性 APS レダクターゼについて前述したように、最初に PAPS 生成の方向で MtPAPSR の活性を測定しようとしました 38。ＰＡＰＳ酸化は、５ｍＭＮａ２ＳＯ３、２ｍＭＰＡＰまたは２ｍＭＡＭＰ（最終濃度）および３．２７μｇｍｌ−１ＭｔＰＡＰＳＲを含有する５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で測定した。反応は、最終濃度０．５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６で開始した。 420 nm での吸光度の減少を測定し、酵素を使用しないバックグラウンド反応について補正しました。活動は検出されませんでした。そこで、生理反応を利用してMtPAPSR活性をモニタリングしました。共役 MtPAPSR アッセイを実行するには、酵素を同時に精製し、すぐにアッセイに使用する必要がありました (このアッセイで使用される酵素の詳細な精製プロトコルについては補足資料を参照)。

MtPAPSR 活性アッセイは、45 °C の嫌気性雰囲気 (100% N2) で実施されました。アッセイは、96 ウェルディープウェルプレートの最終容量 200 μl で実施し、SPECTROstar Nano マイクロプレートリーダーで分光光度的にモニターしました。５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｎＣｌ２および１．５ｍＭＭｇＣｌ２を補充したＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を緩衝液として使用した。還元メチルビオロゲン (MVred、0.5 mM) は、MtPAPSR の電子供与体として機能しました。モル吸光係数 (ε600nm = 8,133.3 cm-1 M-1) は、上記の条件を使用し、2 mM 亜ジチオン酸ナトリウムでメチルビオロゲンを還元することによって実験的に決定されました。アッセイでは、以前に公開されたプロトコル 59 に従って、クロストリジウムオートエタノゲナムの CO-デヒドロゲナーゼによりメチルビオロゲンを一酸化炭素で還元しました。 CO を N2 に交換し、MVred をすぐにアッセイに使用しました。バッファーおよび MVred に、5 mM ATP、1 mM 亜ジチオン酸ナトリウム、0.2 U ピロホスファターゼ (大腸菌、MFCD00131379、Sigma-Aldrich)、0.127 mg ml-1 MtATPS、0.12 mg ml-1 MtAPSK、0.1 mg ml-1 MtPAPPおよび０．０６４５ｍｇｍｌ−１のＭｔＰＡＰＳＲを添加した。 5 mM Na2SO4 を添加することによって反応を開始し、続いて 600 nm で MVred を酸化しました。すべてのアッセイは 3 回繰り返して実行されました。

M.サーモリソトロフィカスからの亜硫酸レダクターゼ活性を測定するために、血清フラスコ中の上記培地10ml中の2mM Na2S、2mM Na2SO3またはNa2SO4のいずれかで培養物を増殖させた。 6,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離することにより、後期指数関数期 (OD600: 2 mM Na2S で 3.45、2 mM Na2SO3 で 3.91、Na2SO4 で 3.37) の細胞 (9 ml) を収集しました。上清を廃棄し、細胞ペレットを液体窒素中で凍結させた。次いで、ペレットを１ｍｌの０．５ＭＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０中に再懸濁した。細胞を超音波処理（強度50%で2×10 秒、プローブMS73、SONOPULS Bandelin）によって溶解し、続いて4℃、15,600×gで遠心分離しました。上清を 0.2 μm フィルターに通し、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定しました (2 mM Na2S については 6.63 mg ml-1、2 mM Na2SO3 については 6.14 mg ml-1、Na2SO4 については 6.31 mg ml-1)。活性アッセイは、嫌気性雰囲気 (100% N2) 、50 °C の 96 ウェルディープウェルプレートで実施し、分光光度計でモニタリングしました (SPECTROstar Nano マイクロプレートリーダー)。アッセイ混合物は、０．５ＭＫＨ２ＰＯ４ｐＨ７．０、１１８μＭＭＶｒｅｄ（最終濃度、等モル量の亜ジチオン酸ナトリウムで予め減少させた）および３０μＭＮａ２ＳＯ３（最終濃度）を含んでいた。これらの条件下で、モル吸光係数 ε600nm = 9,840 cm-1 M-1 が実験的に決定されました。 0.05 μg の細胞抽出物を添加することによって反応を開始し、続いて 600 nm で MVred を酸化しました。すべてのアッセイは 3 回繰り返して実行されました。

系統解析の詳細な説明については、補足資料60を参照してください。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

構造比較に使用されるすべての構造は、Protein Data Bank からアクセスできるため、本文中で引用されています。構造は、ID: MtATPS フォーム 1 の場合は 8A8G、MtATPS フォーム 2 の場合は 8A8D、MtAPSK の場合は 8A8H、MtPAPP の場合は 8A8K、および MtPAPSR の場合は 8A8O として Protein Data Bank に寄託されました。この研究のデータは、論文とその補足情報で入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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マックス・プランク海洋微生物研究所とマックス・プランク協会の継続的な支援に感謝します。ビーム時間の割り当てのためのソレイユシンクロトロンと、データ収集の支援のためのプロキシマ-1 のビームラインスタッフ。 SLS のビームライン X06DA および PETRA III の P11 のスタッフ。 RE プラスミド pDB1281 を提供してくださった DR Dean。 C. Probian と R. Appel は、微生物代謝研究室と Archaeoglobus fulgidus の培養に対する継続的な支援を求めました。イオンクロマトグラフィー測定については、HGF MPG 深海の生態と技術共同研究グループの G. Wegener と M. Alisch が協力してくれました。 U. Ermler、J. Fritz-Steuber、G. Fritz には原稿に関する素晴らしい議論と批判的なコメントをいただきました。この研究は、マックスプランクゲゼルシャフトとノボノルディスク財団 (NNF21OC0070790、TW) から資金提供を受けました。 MJ は、1927 年のドイツ建設計画シュヴェルプンクトプログラム「生命のための鉄と硫黄」 (WA 4053/1-1、MJ) によって支援されました。

マックス・プランク協会が提供するオープンアクセスの資金提供。

微生物代謝グループ、マックス・プランク海洋微生物研究所、ブレーメン、ドイツ

マリオン・ジェスペルセン & トリスタン・ワーグナー

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MJ はメタン生成菌を培養し、この研究に記載されているすべてのタンパク質を精製および結晶化しました。 MJ はすべての生化学的特性評価を実施しました。 MJ と TW は X 線データを収集し、構造を解明しました。 MJ と TW はすべてのモデルを改良し、検証しました。 TW と MJ は研究を計画し、論文を執筆しました。

トリスタン・ワーグナーへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた M. Elizabeth Stroupe と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

同化性 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 減少。 (ルート 1a、1b、1c) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) は、ATP スルフリラーゼ (例: Glycine max、PDB: 4MAF) によって APS に対して活性化されます。 (1a) APS は、APS レダクターゼ (例えば、緑膿菌、PDB: 2GOY、チオレドキシン依存性)。 (1b、c) あるいは、APS は APS キナーゼ (たとえば、シロイヌナズナ、PDB: 3UIE) によってさらにリン酸化されて、PAPS を生成します。 (1b) PAPS レダクターゼ (Saccharomyces cerevisiae、PDB: 2OQ2、チオレドキシン依存性) は PAPS を \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) と PAP に変換します。 PAP は、PAP ホスファターゼ (たとえば、結核菌、PDB: 5DJJ) によって無機リン酸 (Pi) と AMP に加水分解されます。 (1a、b) 亜硫酸還元酵素 (大腸菌、PDB: 1AOP) は \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) を S2− に還元し、その後これを組み込むことができますバイオマスに。経路 1c では、スルホトランスフェラーゼ (たとえば、A. thaliana、PDB: 5MEK) が、PAPS からアルコールまたはアミン受容体へのスルホ基 (R-OSO3-) の転移を触媒します。異化的 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 削減。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) は ATPS によって APS にアクティブ化され、さらに \({{\rm{SO}}}_{3}^{ 2-}\) は、2 つの [4Fe-4S] クラスターと 1 つの FAD を含む APS レダクターゼ (Archaeoglobus fulgidus、PDB: 2FJA) によって生成されます。亜硫酸レダクターゼ (A. fulgidus、PDB: 3MM5 など) は \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) を還元し、キャリア DsrC 上で分岐させます。膜複合体 DsrMKJOP (例: Allochromatium vinosum) は、エネルギー保存のためのイオン移動と同時に硫黄を HS- に還元します。シロヘム、FAD、および [4Fe-4S] クラスターは棒と球で表され、炭素、酸素、窒素、硫黄、鉄がピンク、赤、青、黄色、オレンジで色付けされています。酵素は、オリゴマー状態で漫画および透明な表面で示されています。 A. fulgidus の ATPS は、Alphafold232 を使用してモデル化され、緑色で色付けされています。追加の GTP を使用する二機能性 ATP スルフリラーゼ CysDN は、スキームを簡略化するためにここでは示されていません。

M. サーモリソトロフィカスの \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) 耐性。古細菌は \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (灰色の四角形)、\({{\rm{SO}}}_{4}^{2) で成長しました。 -}\) に等モル量の \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (小麦の正方形) と \({{\rm{SO}}}_{ 4}^{2-}\) に過剰な \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) が追加されました (濃い赤色の四角形)。対照として、Na2S 増殖培養物 (S2-、黒三角) と過剰な \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) を含む Na2S 増殖培養物 (赤三角) を使用しました。。この増殖実験は二重に実行されました。 b, \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 比率の影響0.5 mM Na2SO4 上で増殖させた M. サーモリソトロフィカス培養物中で。灰色の四角は、\({{\rm{MoO}}}_{4}^ を添加しない場合の \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元剤の成長曲線を示します。 {2-}\)。赤い四角は、5 mM の \({{\rm{MoO}}}_{4) に曝露された \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元剤の増殖曲線を示します}^{2-}\)、続いて 25 mM Na2SO4 を添加します。黒い破線の矢印は \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) と \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-} の時間を示します) \）追加。この増殖実験は 3 回繰り返して実行されました。 c、Archaeoglobus fulgidusの\({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\)に対する感受性。ここで、 \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) の比率はA. fulgidus の増殖を阻害するには 0.001:1 で十分です。表示されているデータは、最低値と最高値を除いて 4 つあります \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4} ^{2-}\) 比を 3 回繰り返して実行しました。すべての実験はデータ平均として表され、b、c ±標準偏差 (sd) として表されます。

ソースデータ

a、表面表現におけるATPSの比較。ドメイン組成I（黄色）、II（薄緑色）、III（小麦）およびAPSキナーゼ（濃いオレンジ色）で色分けされています。灰色の表面は反対側のモノマーに対応します。 ScATPSはホモ六量体として組織されます。 b、MtATPS (黄色)、TtATPS (灰色)、ScATPS (紺色)、RrsATPS (マゼンタ)、GmATPS (緑色)、および AaATPS (シアン) のモノマーがドメイン II に重ねられ、漫画として表示されます。略語とrmsdは補足表1に記載されています。c、d、MtATPS（c）およびTtATPS（d）のオリゴマー化に関与する表面積。 1 つのモノマーは表面表現で示され、1 つのモノマーは漫画で表示されます。 1 つの鎖のドメイン III によって確立されたモノマー-モノマー接触 (MtATPS の場合はオレンジ色、TtATPS の場合は黒色) は、赤い表面として示されています。小麦色の表面はドメイン III を強調しています。枠で囲まれた入口は、Zn 結合モチーフの拡大図であり、Zn に配位する残基が棒として描かれています。炭素、窒素、硫黄はそれぞれオレンジ/白、青、黄色に色付けされます。 e、f、MtATPS (apo、e) および APS が結合した TtATPS (f) の触媒部位。要素は入口 (c、d) と同様に、酸素とリンがそれぞれ赤とオレンジで着色されています。 ATPS の標準モチーフに属する残基は、ピンク色の炭素原子によって強調表示されます。

a、ホモオリゴマーATP依存性スルフリラーゼ（sat）を伴うヘテロダイマー硫酸アデニリルトランスフェラーゼ（CysDN）、およびb、APSキナーゼ。パネル a: ヘテロ二量体の同化性 ATP スルフリラーゼは、調節 GTPase サブユニット CysN (薄赤色) と触媒サブユニット CysD (青色) で構成されます。 Sat は、同化性と異化性の両方の \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) 還元に関与しています (薄オレンジ色)。 MtATPS と MtAPSK は太字の赤色で強調表示されます。ブートストラップサポート値 ≥90 % は、内部ノードのドットとして表示されます。

a、左パネル、最も近いホモログであるSynechocystis sp.と重ね合わせたホモ二量体MtAPSK apo（オレンジ）。 APS および AMP-PnP と複合した PCC 6803 (SsAPSK、白、PDB: 5CB6)。リガンドは棒と球で示され、MtAPSK の欠落部分 125 ～ 152 (ボールで示されている) は SsAPSK では黒で強調表示されます。炭素、窒素、酸素、硫黄、リンはそれぞれ明るいオレンジ/白/シアン、青、赤、黄色、オレンジ色に着色されています。右パネル: MtAPSK (小麦)、AtAPSK (オレンジ、PDB: 3UIE)、ApAPSK (スレート、PDB: 2YVU)、および PcAPSK (白、PDB: 1M7H) を 1 つのモノマーに重ね合わせたものを漫画で示します。活性部位の位置は黒い矢印で示されます。略語とrmsdは補足表2に記載されています。b、c、APSおよびAMP-PnPに結合したアポMtAPSK（b）およびSsAPSK（c）の触媒部位。要素は (a) の左パネルのように色付けされます。 (b) では、矢印は欠落部分 125 ～ 152 を示します。

a、MtPAPP、枯草菌由来のNanoRNase A (BsNrnA、PDB: 5IUF)、およびデイノコッカス・ラジオデュランス由来のリコンビナーゼRecJ (DrRecJ、PDB: 5F55)にわたるフォールディング保存。 BsNrnA および DrRecJ の場合、構造は DHH および DHHA1 ドメインのみを表し、MtPAPP との比較を簡素化するために二次構造モチーフの番号が付け直されています。 b. MtPAPP、NanoRNase A、およびリコンビナーゼ RecJ 間のヌクレオチド結合の違い。表面残基は緑色のリガンドと相互作用します。 c、MtPAPP、BsNrnA (PDB: 5IZO)、および DrRecJ (PDB: 5F55) の間の Mn2+ 配位の拡大図。 Mn2+ は紫色の球として示され、それらを配位する残基は棒と球として強調表示されます。炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子はそれぞれ緑/灰色、青、赤、オレンジ色に着色されています。標準的な DHH モチーフに属する残基は、ピンク色の炭素原子を持っています。 BsNrnA に使用される構造は His103Ala バリアントであり、His160 の側鎖は DrRecJ 構造ではモデル化されていません。

a、二機能性オリゴリボヌクレアーゼとPAP-ホスファターゼ、およびエキソヌクレアーゼ（RecJ）を含むPAP-ホスファターゼ、およびb、異化性APS-レダクターゼ（α-サブユニット）および（推定）同化性APS/PAPS-レダクターゼ。 MtPAPSR と MtPAPP は太字の赤色で強調表示されます。ブートストラップサポート値 ≥90 % は、内部ノードのドットとして表示されます。 Methanocaldococcus jannaschii 配列の前のアスタリスク (*) は、以前に生化学的に特徴付けられた 2 つの酵素を強調しています。

a、N2雰囲気下、45℃で600nmでの還元メチルビオロゲン（MVred）の酸化を介してMtPAPSR活性を測定するために使用される共役酵素アッセイのスキーム。市販されているピロホスファターゼを除き、酵素は大腸菌内で組換え発現させた。反応混合物には、すべての酵素、金属 (Mn2+、Mg2+)、pH 7.0 の HEPES 緩衝液、基質 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) および ATP が含まれていました。 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) を添加すると反応が開始されました。 b、c、「ブランク」は、緩衝液、基質、MVred、亜ジチオン酸を含むが酵素を含まない溶液に対応します。「全成分」には、スキーム（ａ）に示されるすべての化合物が含まれていた。 b、MtPAPSRの基質特異性。「No MtAPSK」は、APS から PAPS の生成を防ぐ MtAPSK を除くすべてのコンポーネントに対応します。基質として APS を使用すると、PAPSR の酸化型 MV.min-1.mg-1 の 0.007 ± 0.001 μmol の比酵素活性が測定されました。これは、APSK での活性のわずか 6.54 % にすぎません (図 4a、+に対応) APS -ATPS -APSK)。この違いは、追加された APS の不安定性に起因すると考えられます。 c. 活性に対するさまざまな濃度のMtPAPSRの影響: MtPAPSRを5倍添加すると、MV酸化速度が220%刺激されました(濃い緑色の四角で示す、「5倍以上のMtPAPSR」)。 30 分後、MtPAPS レダクターゼを 5 倍添加すると凝集が起こり、この時点以降 OD600nm が増加し始めたのはこのためです。すべての実験は 3 回繰り返して実行され、データ平均値 ± SD として表されました。

ソースデータ

すべての構造は、ボールとスティックの (メタロ) 補因子とともに漫画で示されています。基質結合に重要な残基を含む活性部位（右側）の拡大図は、球と棒として強調表示されています。 Archaeoglobus fulgidus の異化性 APS レダクターゼは、2 つの (αβ) サブユニットから構成されるヘテロ四量体です。各 β サブユニットには 2 つの [4Fe-4S] クラスターが含まれ、各 α サブユニットには 1 つの FAD が含まれます。提示された緑膿菌由来の同化性 APSR はホモテトラマーです。モノマーごとに 1 つの [4Fe-4S] クラスターが含まれています。出芽酵母由来の同化性 PAPSR はホモ二量体です。酸素、窒素、リン、硫黄、鉄という元素は、それぞれ赤、青、オレンジ、黄色、茶色に色付けされています。基材/製品のカーボンはシアン、FAD の場合は黄色に色付けされます。触媒残基は赤いラベルで強調表示されます。

補足図。 1 ～ 8、表 1 および 2、構築物および遺伝子コドンの最適化、および考察。

補足資料ファイル。

補足図2の統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

未処理のネイティブゲル。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Jespersen, M.、Wagner, T. 海洋メタン生成菌 Methanothermococcus Thermolithotrophicus における同化的硫酸塩還元。ナットマイクロバイオル (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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受信日: 2023 年 2 月 28 日

受理日: 2023 年 4 月 26 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8

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