Gαiノックの発生 | 山東鍛造グループ

Communications Biology volume 6、記事番号: 112 (2023) この記事を引用

3075 アクセス

13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、細胞外分子を感知して細胞反応を活性化する極めて重要な細胞膜タンパク質です。 G タンパク質 α サブユニット i (Gαi) ファミリーは、最も一般的な GPCR カップリングパートナーを表し、異なるシグナル伝達特性を持つ 8 つのサブユニットで構成されます。しかし、事実上すべての細胞株における Gαi サブユニットの内因性発現により、共役パターンの分析は困難でした。ここでは、すべての Gαi サブユニットを欠く HEK293 細胞株を作製します。これにより、特定の Gαi サブユニットの一過性再発現時の GPCR-Gαi 共役の測定が可能になります。私たちは、cAMP 蓄積に対するリガンド誘導性の阻害活性を測定することにより、11 個の GPCR にわたる Gαi 共役選択性をプロファイリングします。次に、結合プロファイルは、Gαz に優先的に結合するもの、Gαo に結合するもの、および明らかな選択性を持たないものを表す 3 つのクラスターに分類されます。これらの結果は、個々の Gαi 共役 GPCR が、Gαi サブユニットレベルで共役優先を発揮することによって Gαi シグナル伝達を微調整していることを示しています。

G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、細胞外刺激を下流の細胞内シグナルに結び付ける重要なトランスデューサーであり、医薬品開発の最も一般的なターゲットです1。 GPCR リガンドが結合すると、α、β、γ サブユニットからなるヘテロマーグアニンヌクレオチド結合タンパク質 (G タンパク質) がエフェクタータンパク質の活性化を誘導します。 3 つのサブユニットのうち、α サブユニットは主に個々のヘテロ三量体 G タンパク質の重要な特性を決定します。ヒトゲノムは 16 個のαサブユニットをコードしており、それらは配列相同性と機能類似性に基づいて 4 つのサブファミリー、すなわち Gαs、Gαi、Gαq、および Gα122 に分類されます。 Gαi サブファミリーは、ファミリー A GPCR の中で最も一般的なカップリングパートナーです 3,4。さらに、米国食品医薬品局 (FDA) が承認した薬剤の標的となる GPCR の約 45% は Gαi サブファミリーと結合しており 5、Gαi 共役 GPCR の薬剤標的としての重要性が強調されています。

これまでの研究では、Gαi サブユニットには重複する機能と異なる機能の両方があることが示されています。 Gαi サブファミリーは、Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαt1、Gαt2、Gαt3、Gαo、および Gαz の 8 つのα サブユニットで構成されます。 Gi ヘテロ三量体の活性化は、アデニリルシクラーゼやカルシウムチャネルの阻害、カリウムチャネルの活性化など、さまざまな細胞シグナル伝達プロセスを誘導します6。 Gαi サブファミリー内の高い配列相同性にもかかわらず、いくつかのサブユニット特異的機能が報告されています。例えば、トランスデューシン (Gαt1 および Gαt2) とガストデューシン (Gαt3) は、それぞれ cGMP ホスホジエステラーゼを活性化することにより視覚と味覚に関与しています 7,8。さらに、GH4C1 細胞における Gαi サブユニットのノックダウン実験を使用して、Gαo と Gαi2 がそれぞれカルシウム侵入と cAMP 蓄積の阻害を媒介することが判明しました9。 Gαi サブユニットは生化学的にも互いに異なる挙動をします。ただし、Gq で観察されるように、これらの生化学的特性は生細胞内で変更される可能性があることに注意してください。Gq では、脂質膜状態よりも精製状態の方がヌクレオチドの解離が遅いことが示されています。たとえば、Gαo からの自発的 GDP 解離速度は Gαi1-310 よりも一桁速く、Gαz の固有 GTPase 活性は他の Gαi サブユニットより 200 倍遅い 11。 Gαi ファミリーのメンバー間のこれらの違いにより、多様な Gαi 共役 GPCR シグナル伝達が可能になります。

Gαi サブユニットのシグナル伝達特性は十分に特徴付けられていますが、GPCR の Gαi サブユニット共役選択性は、実験の困難さのため、限られた数の受容体についてしか研究されていません。事実上すべての哺乳類細胞は複数の Gαi サブユニットを内因的に発現しているため、個々の GPCR-Gαi 共役は、単に目的の Gαi サブユニットを発現させるだけでは評価できません 12。内因性 GPCR-Gαi 共役を排除するために、これまでの研究では、Gαi サブユニットの C 末端尾部のシステイン残基を ADP リボシル化する百日咳毒素 (PTX) が使用されてきました 13。システイン残基が置換された PTX 耐性 Gαi 変異体を発現させることにより、PTX 処理により変異体 Gαi サブユニットの選択的共役の測定が可能になります 14,15,16。ただし、システイン残基を変更すると、α サブユニットの G タンパク質結合能力に影響を与える可能性があります 17、18。さらに、PTX は PTX 標的部位にイソロイシンを持っているため、Gαz を阻害しません 19。最近、蛍光または生物発光共鳴エネルギー移動に基づく技術が、個々の操作された Gα サブユニットの結合を評価するために使用されています 20,21。しかし、これらの方法ではルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質をαサブユニットに挿入する必要があり、そのような修飾はその生化学的特性と結果として生じるカップリング効率に影響を与えます22。

この研究では、ヒト胎児腎臓 (HEK) 293A 細胞における Gαi ヌルバックグラウンドを確立するゲノム編集アプローチを採用することで、個々のインタクトな Gαi サブユニットを測定する際の実験的困難を回避しました。 GPCRと目的のGαiサブユニットのペアをGαi欠損HEK293A細胞に一過的に発現させることにより、11個のGPCRにおけるGαi共役プロファイルの特徴付けに成功し、これらのGPCRに対するGαiサブユニットの生理学的に合理的な選択性を見出した。

Gαi サブユニット結合パターンの機能解析のための Gαi ヌルバックグラウンドを確立するために、すべての Gαi サブユニットを欠く HEK293A 細胞株を生成しました。まず、定量的 RT-PCR 分析によって HEK293A 細胞における Gαi サブユニットの発現を測定しました。 7つのGαiサブユニットをコードする遺伝子（GNAI1、GNAI2、GNAI3、GNAO1、GNAT1、GNAT2、GNAZ）が発現しましたが、GNAT3の発現は検出できませんでした（図1a）。 GNAT3 の PCR プライマーペアを検証するために、GNAT3 が発現していることが知られている小腸組織サンプルにおける GNAT3 発現を測定および確認しました 23 (補足図 1)。次に、3ラウンドのCRISPR-Cas9突然変異誘発を使用して、HEK293A細胞に存在する7つのGαiサブユニットをコードする遺伝子を標的にしました（図1b）。我々は、各αサブユニットの N 末端半分内で二本鎖 DNA 切断を誘導するシングルガイド RNA (sgRNA) を設計しました。これらの sgRNA によるフレームシフトまたはナンセンス変異の導入が成功すると、変異遺伝子は受容体の共役に関与する C 末端の α5 ヘリックスを除去した切断型 Gαi サブユニットを生成すると予想されます 24。 sgRNA コンストラクトのトランスフェクション、GFP 陽性細胞の蛍光活性化セルソーティング単離、およびクローン細胞コロニーの拡大後、制限酵素法を使用してクローンの標的遺伝子の変異をスクリーニングし、ノックアウトクローンを取得しました。候補（ΔGαi 細胞）（図 1c）。標的ゲノム領域のサンガー配列決定により、ΔGαi細胞がすべての標的対立遺伝子にフレームシフト変異または終止コドンを含む大きな挿入を持っていることが確認されました（補足図2）。 GNAT3 発現は、ΔGαi 細胞では検出されないままでした（補足図 1）。これらの結果は、7 つの Gαi サブユニットをコードする遺伝子が HEK293A 細胞内で首尾よく変異して、それらの内因性発現を防止したことを示しています。

a 親 HEK293A 細胞の Gαi サブユニットの定量的リアルタイム PCR 分析。バーとエラーバーは、それぞれ 3 回の独立した実験の平均値と平均値の標準誤差 (SEM) を表します。各実験は二重に実行されました。略語: ND、検出されません。 b Gαi ファミリーメンバーの遺伝子不活化戦略。 ΔGαi 細胞は、3 ラウンドの CRISPR-Cas9 変異誘発を使用して取得されました。 c 制限酵素消化フラグメント法を使用した Gαi 変異体クローン遺伝子型の同定。 sgRNA ターゲットは PCR 増幅され、対応する制限酵素 (RE) で処理されました。消化されたサンプルをキャピラリーエレクトログラフ分析に供し、エレクトロフェログラムの擬似ゲル画像を、pUC19/Hpa II 消化の DNA マーカーを使用して視覚化しました。黒と赤の矢印は、それぞれ、標的部位の未消化および RE 消化された PCR フラグメントを示します。 GNAI2 遺伝子と GNAT1 遺伝子の PCR フラグメントには 2 つの RE 部位があり、GNAI1 遺伝子の変異対立遺伝子の 1 つは RE によって消化される可能性があることに注意してください。略称：Pペアレンタル、KOノックアウト。

次に、GloSensor cAMP アッセイを使用して、ΔGαi 細胞における Gαi サブユニットの欠如を機能的に検査しました。我々は、典型的なGαi共役受容体であるμ-オピオイド受容体（MOR）をGloSensor cAMPレポーターとともに発現させ、リガンドであるメチオニンエンケファリン（MetEnk）とフォルスコリンによる刺激時のcAMPレベルを測定した。親細胞では、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積は、MetEnk濃度依存的にほぼ完全に阻害されました（図2a）。対照的に、ΔGαi 細胞は MetEnk に対して完全に反応しませんでしたが、外因性 Gαi2 発現によりリガンドに対する反応が回復しました (図 2b)。これらの結果は、ΔGαi 細胞には機能的な Gαi サブユニットが欠如しており、Gαi サブユニットシグナル伝達の研究に適していることを示しています。

a、b 親細胞（a）およびΔGαi細胞（b）におけるGloSensor cAMPアッセイの濃度応答曲線。 MOR および Gαi2 を含む Glo-22F cAMP レポーターを一時的に発現する親細胞および ΔGαi 細胞を、指定濃度の MetEnk とともに 10 μM フォルスコリンで刺激しました。各実験では、フォルスコリン誘発 cAMP 蓄積を 100% に設定しました。両方の図において、記号と誤差バーはそれぞれ 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。各実験は 3 回繰り返して実行されました。多くのデータポイントでは、エラーバーがシンボルのサイズより小さいため、表示されないことに注意してください。

ΔGαi 細胞をさらに特徴付けるために、親細胞とΔGαi 細胞の細胞増殖を比較しました。播種から 48 時間後に細胞を収集し、細胞数をカウントすることで細胞増殖を評価しました。 48時間後のΔGαi細胞の細胞増殖は、親細胞と比較して20％減少しました（補足図3）。 ΔGαi 細胞と同様に、PTX 処理した親細胞も、未処理の親細胞と比較して細胞増殖が 20% 減少しました。この結果は、ΔGαi 細胞における細胞増殖の抑制がクローン効果によるものではなく、Gαi タンパク質のオンターゲット欠損によるものであることを示唆しています。さらに、ΔGαi 細胞と PTX 処理した親細胞の増殖の低下は、I 型コラーゲンでコーティングしたディッシュで細胞を培養することで両方とも回復しました (補足図 3)。これは、細胞増殖の抑制が細胞の弱化によるものであることを示唆しています。 ΔGαi細胞の接着。

他の G タンパク質シグナル伝達が ΔGαi 細胞で影響を受けるかどうかを調べるために、Gs、Gq、および G12 シグナル伝達を個別に評価しました。 ΔGαi 細胞と親細胞の両方で、Gs 共役バソプレシン V2 受容体 (V2R) またはドーパミン D1 受容体 (D1R) を GloSensor cAMP レポーターとともに発現させました。次に、細胞をアゴニストまたはフォルスコリンで刺激し、cAMP 蓄積を測定しました。 ΔGαi 細胞における Gs シグナル伝達は、親細胞における Gs シグナル伝達と比較して増強されました (図 3a、b)。次に、Gq- (H1R および α1A) または G12- (EP3 および CB1) 共役 GPCR を使用したトランスフォーミング成長因子 (TGF) α シェディングアッセイ 25 を介して、Gq および G12 シグナル伝達を測定しました。 Gタンパク質欠損細胞を使用することにより、我々は、テストしたGq-GPCR（H1Rおよびα1A）およびテストしたG12-GPCR（CB1およびEP3）によって誘導されるTGFαシェディング応答がGq/11およびG12/にのみ依存していることを以前に検証しました。それぞれ13、3。各 GPCR を、ΔGαi 細胞および親細胞でアルカリホスファターゼタグ付き TGFα (AP-TGFα) レポーターとともに発現させ、その後、リガンド誘導性の AP-TGFα 外部ドメイン脱落応答を測定しました。 ΔGαi細胞におけるGqおよびG12シグナル伝達は、親細胞のものと同等でした（図3c〜f）。これらのデータは、Gαi サブユニットの除去は Gq および G12 シグナル伝達に影響を及ぼさないが、おそらく Gs と Gi 間のアデニリルシクラーゼにおける競合の喪失により、Gs シグナル伝達を増強することを示しています。

a、b Gs 媒介 cAMP 蓄積の濃度応答曲線。 D1R (a) または V2R (b) のいずれかとともに Glo-22F を一時的に発現する親細胞およびΔGαi 細胞を、それぞれ示された濃度のドーパミンまたはアルギニンバソプレッシン (AVP) で刺激しました。 c – f 親およびΔGαiにおけるGq-（H1R（c）およびα1A（d））およびG12共役受容体（CB1（e）およびEP3（f））の活性化によって誘導されるTGFα放出反応の濃度-応答曲線細胞。試験 GPCR を親細胞および ΔGαi 細胞で AP-TGFα レポーターとともに発現させ、結果として生じるリガンド誘導性の応答を評価しました。すべての図において、記号と誤差バーは、それぞれ 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。各実験は 3 回繰り返して実行されました。多くのデータポイントでは、エラーバーがシンボルのサイズより小さいため、表示されないことに注意してください。

さらに、例としてMORを使用して、Gi結合GPCRがGαiタンパク質の非存在下で他のGαタンパク質にアクセスできるかどうかを調べました。図2bに示すように、MOR活性化はΔGαi細胞のcAMPを増加させず、Gαiの非存在下でもGαiと共役しないことを示しています。我々はさらに、TGFαシェディングアッセイを用いて、Gαi欠損状態においてMORがGqおよびG12と共役するかどうかを調べた。我々は、MORが親細胞とΔGαi細胞の両方で検出可能なTGFα放出反応を示さないことを発見しました（補足図4）。これは、Gαiタンパク質が存在しない場合でもMORがGqおよびG12と共役できないことを示しています。注目すべきことに、Gi共役GPCRに結合しGqシグナル伝達を伝達するGαq/i1キメラGαタンパク質をポジティブコントロールとして使用することにより、TGFαシェディングアッセイにおけるMORの活性化を検証しました（補足図4）。これらのデータは、優先 Gα が存在しない場合でも MOR が非優先 Gα と共役しないことを裏付けていますが、他の Gi 共役 GPCR が異なる動作をする可能性を排除することはできません。したがって、Gα 欠損細胞を使用して G タンパク質の共役を分析する場合は、この可能性を考慮することが推奨されます。

我々は、ΔGαi 細胞内で目的の GPCR サブユニットと Gαi サブユニットのペアを発現させることにより、GPCR-Gαi 共役プロファイルを評価しました。残りの Gαi サブユニット (Gαt1、Gαt2、および Gαt3) の生理学的エフェクタータンパク質が既知であるため、以下の特性評価のために 8 つの Gαi サブユニットのうち 5 つの Gαi サブユニット、つまり Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、および Gαz を選択しました。 cGMPホスホジエステラーゼとなります。

アッセイにおけるプラスミドの適切な量を決定するために、GPCR または Gαi サブユニットをコードする複数の量のプラスミドをテストし、濃度応答曲線を比較しました。まず、MORをコードするプラスミド（すべてのMOR条件に対して100 ngのGαi1プラスミド）を滴定することにより、研究で使用される代表的なGPCRであるMORの膜発現レベルを測定しました。 8〜200 ngのプラスミド用量（6ウェルプレートのウェルあたり）から発現レベルが増加し、そのレベルは1000 ngの条件ではそれ以上上昇しませんでした（補足図5a、b）。次に、GloSensor アッセイによって Gi 媒介 cAMP 応答を測定しました。濃度 - 反応曲線は、プラスミドの量が増加するにつれて左にシフトし、200 ngの量で頭打ちになりました（補足図5c）。したがって、その後の実験では、テスト GPCR をコードするプラスミド 200 ng を使用しました。 Gα の場合、MOR をコードするプラスミドを 200 ng に固定し、5 つの Gαi サブユニットすべてのプラスミド量を 1 から 1000 ng まで 10 倍に滴定しました。 1 ngのプラスミド用量は無視できるcAMP抑制効果を示しましたが、10 ngのプラスミド用量はcAMP産生を部分的に阻害しました（補足図5d）。 100 ng および 1000 ng のプラスミド用量は、cAMP 産生をほぼ完全に阻害しました。プラスミド量が 10 ～ 1000 ng の場合、プラスミド用量が増加するにつれて濃度反応曲線が右にシフトする傾向があることがわかりました。併せて、その後の実験は、Gαi をコードするプラスミドの用量 100 ng で実施されました。

GloSensor cAMP アッセイは、Gαi よりも Gαs の活性化を優先的に検出するため、ドーパミン D2 受容体 (D2R)、ドーパミン D4 受容体 (D4R)、μ 型オピオイド受容体 ( MOR)、ソマトスタチン受容体 2 型 (SSTR2)、カンナビノイド受容体 1 (CB1)、リゾホスファチジン酸受容体 1 (LPA1)、スフィンゴシン 1-リン酸受容体 1 (S1P1)、スフィンゴシン 1-リン酸受容体 3 (S1P3)、おそらく G タンパク質共役受容体 34 (GPR34)、C-C ケモカイン受容体 2 型 (CCR2)、および CC ケモカイン受容体 5 型 (CCR5)。ドーパミン、セロトニン、メチオニンエンケファリン、ソマトスタチン、リゾホスファチジン酸、スフィンゴシン 1-リン酸、リゾホスファチジルセリン、CCL2、および CCL4 を含む内因性リガンドが、高親和性合成リガンド (CP-55490) である CB1 を除くすべての GPCR に使用されました。アナンダミドなどの内因性リガンドはアッセイで反応が悪いため、使用されました。 GPCRごとに、5つのGαi条件と1つのGαi非トランスフェクト条件からのcAMP応答をプロットしました（図4a、補足図6）。滴定されたリガンド濃度に対する cAMP 蓄積の阻害をグラフ化し、シグモイド濃度反応曲線に当てはめ、そこから最大半値濃度 (EC50) と最大反応 (Emax) の値を取得しました (補足表 1)。我々は、11 個の GPCR 間で Gαi サブユニット結合の異なるパターンを発見しました。たとえば、D2R では、試験したすべての Gαi サブユニットは同等の飽和濃度 (Emax 値に相当) をもたらしましたが、Gαo 発現条件における濃度反応曲線は左にシフトし、これは EC50 値の違いを反映しています。観察されたD2RのGαo優先性は、D2Rが最も効果的にGαoと共役することを示したSf9細胞および無傷のGαiサブユニットを用いた以前の研究と一致している26,27。一方、LPA1 では、飽和濃度での cAMP 抑制応答は Gαi1-3 と Gαo で同等でしたが、Gαz では応答が小さかったです。

a GPCR サブユニットと Gαi サブユニットの特定の組み合わせを含む Glo-22F を一時的に発現する ΔGαi 細胞における GloSensor cAMP アッセイの濃度応答曲線。細胞を、10 μM フォルスコリンと指定濃度のリガンドで刺激しました。各実験では、フォルスコリン誘発 cAMP 蓄積を 100% に設定しました。すべての図において、記号と誤差バーは、それぞれ 3 回の独立した実験の平均値と SEM を表します。各実験は 3 回繰り返して実行されました。一部のデータポイントでは、エラーバーがシンボルのサイズよりも小さいことに注意してください。 b RAi 値を計算するプロセスを示す概略図。 c 11 個の GPCR の LogRAi 値のヒートマップ。色の範囲は白 (LogRAi = −1.5) から赤 (LogRAi = 0) までです。受容体は、結合プロファイルから計算された階層的クラスタリングの樹状図に従って配置されます。

受容体全体の Gαi サブユニット共役選択性を均一な方法で比較するために、相対固有活性 (RAi) として知られるパラメーターを計算しました 28。 RAi 値は、EC50 と Emax の両方を考慮する単一のパラメーターです。 RAi は一般にリガンドの偏りを評価するために使用されますが、本発明者らはこれを Gαi サブユニットに対する受容体の優先性を評価するために使用しました。各シグモイド曲線について、EmaxをEC50で除算し、得られたEmax / EC50値を5つの試験されたGαiサブユニット間の最大Emax / EC50値で正規化し、無次元の相対Emax / EC50値（RAiとして定義、図4b）を生成しました。さらに、RAi 値（LogRAi）を対数変換し、Gαi サブユニット共役指標として使用しました。階層的クラスター分析を適用してGPCRを分類し、それらのGαiサブユニット共役指数をクラスタリングツリーを備えたヒートマップとして示しました（図4c）。クラスタリング分析では 3 つのグループを観察しました。クラスター 1 (S1P1、CCR2、S1P3、D4R、および MOR) は Gαz に効率的に結合し、続いて Gαi1-3 および Gαo が続きました。クラスター 2 (D2R) は Gαo に結合し、次に Gαi1 ～ 3、次に Gαz が結合しました。クラスター 3 (CB1、CCR5、GPR34、SSTR2、および LPA1) は、特定の Gαi サブユニットに対する選択性を示さなかった。 Gαi カップリングに基づくクラスタリングを GPCR 系統樹と比較しました。 GPCRdb (https://gpcrdb.org) のアミノ酸類似性とリガンドのグループ分けに基づいて、テストされた受容体は脂質受容体 (LPA1、S1P1、S1P3、CB1)、オーファン受容体 (GPR34)、アミン作動性受容体 (D2R) に分類されました。、D4R）、ケモカイン受容体（CCR2およびCCR5）、およびペプチド受容体（MOR、SSTR2）。興味深いことに、この分類はカップリングベースのクラスタリングとは異なります。これらの結果は、進化の観点から、各 GPCR がさまざまな Gαi サブユニット選択性を個別に獲得したことを示唆しています 29。

本研究では、GPCR の Gαi サブユニット結合優先性をより効果的に研究するために、Gαi 欠損 HEK293A 細胞株、ΔGαi 細胞を樹立しました。研究者らはこれまでに、PTX を使用して内因的に発現した Gαi ファミリータンパク質を阻害しました。ただし、PTX 非感受性変異体は、PTX 処理条件における個々の Gαi サブユニットシグナル伝達を評価する必要があります。さらに、PTX は Gαz を阻害できません。 OZITX と呼ばれる大腸菌百日咳毒素様 AB5 毒素が、Gαz30,31 を含むすべての Gαi サブファミリータンパク質を阻害することが最近発見されました。この毒素であっても、Gαi サブファミリータンパク質を OZITX に対して非感受性にするには、結合特性に影響を与える可能性がある Gαi C 末端変異が必要です。 ΔGαi 細胞はこれらの実験的問題を克服し、GPCR-Gαi サブユニットの結合だけでなく、完全な個々の Gαi サブユニットの下流シグナル伝達の研究を可能にします。

Gαo に対する D2R および Gαz に対する D4R の共役選択は、生理学的機能に適したシグナル伝達特性を提供します。 Gαz は自発的 GDP 解離速度が遅く、固有の GTPase 活性も低い11。 D4R は網膜で発現され、光適応視覚の概日性を制御します 32,33。 D4R と Gαz は両方とも光受容細胞で発現され、夜間にピークとなる毎日の発現パターンを示します 34。 D4R と Gαz の効率的な結合により、Gαz の長期活性化特性を利用して、視覚の概日性の制御が可能になる可能性があります。 D2R は系統発生的に D4R に最も類似しており、一緒に D2 様受容体を構成しますが、D2R は効率的に Gαo に結合します。 Gαz とは対照的に、Gαo は他の Gαi サブユニットよりも速い自発 GDP 解離速度を持っています 10。したがって、D2R は Gαo を介した高速応答シグナル伝達特性を備えている可能性があり、これによりニューロン間の迅速なシグナル伝達が可能になる可能性があります。まとめると、D2R と D4R は、差動結合の選択性を利用して、ドーパミン作動性シグナル伝達の結果を適切な期間持続させる可能性があります。 GPCR のシグナル伝達特性は細胞の Gα 発現プロファイルとその局在にも依存しており、細胞種によって異なりますので、in vivo での D2R および D4R のシグナル伝達特性は今後の研究でさらに調査する必要があります。

MOR は鎮痛薬の重要な薬物標的です。 PTX および PTX 非感受性 Gαi サブユニットを使用した以前の研究では、MOR は Gαi1 および Gαi214 よりも Gαi3 および Gαo とより効果的に共役しました。しかし、我々の実験条件では、MOR は Gαi1-3 および Gαo とほぼ同等に結合します。 2 つの研究間の Gα タンパク質の量の違いもカップリングに影響を与える可能性がありますが、この観察された違いは、PTX に対する耐性を与えるために前の研究で Gαi サブユニットの C 末端変異を使用したことによるものである可能性があり、インタクトな Gαi サブユニットを使用して Gαi サブユニット選択性を評価することの重要性。さらに、αサブユニットを修飾しないGαi1-3およびGαoと並行して、GαzのMORのカップリングを測定しました。インビボ実験により、モルヒネ誘発性鎮痛効果における Gαi ファミリーメンバーの異なる役割が明らかになりました。慢性投与では Gαz が 35,36、急性鎮痛作用では Gαi2 と Gαo が 37,38 です。同じ受容体上で異なるエフェクター活性化を誘導する偏ったリガンドを考慮すると、Gαz 偏った MOR アゴニストは、耐性が低い可能性がある長時間作用性鎮痛の発現につながる可能性があります。まとめると、MOR アゴニストの Gαi サブユニット選択性を評価することは、最終的に薬物活性の違いについての理解を深め、より望ましい鎮痛薬の発見に貢献する可能性があります。

以前に生成した ΔGαs、ΔGαq、および ΔGα12 細胞 42、43、44 に加えて、現在、4 つの Gα ノックアウト細胞株の完全なセットが得られています。これらの細胞株を使用して GPCR の下流の Gα シグナル伝達を個別に調査することができ、これにより GPCR シグナル伝達に関する理解が深まり 45、最終的にはより最適な治療効果を持つ薬剤の開発が可能になります。

MetEnk (4042-v) およびソマトスタチン (4023-v) は Peptide Institute から購入しました。 S1P (62570) および CP-55490 (90084) は Cayman Chemical から購入しました。ドーパミン（040-15433）は富士フイルム和光純薬より購入しました。 LPA (867130) および LysoPS (858143) は Avanti Polar Lipid から購入しました。 CCL2 (Z03292) および CCL4 (Z02831) は Genscript から購入しました。 Glosensor cAMP アッセイ 3 および TGFα シェディングアッセイ 25 で使用されるプラスミドは以前に記載されています。

HEK293A 細胞 (Thermo Fisher Scientific) およびその誘導体 ΔGαi 細胞は、10% ウシ胎児血清 (Gibco、Thermo Fisher Scientific)、0.006% (w/v) ペニシリンおよび 0.01% (w/v) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、日水製薬) で維持されました。 % (w/v) ストレプトマイシン (完全 DMEM)、5% CO2 で平衡化した加湿インキュベーター内で 37 °C に維持しました。トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（PEI）溶液（ポリエチレンイミン「Max」、Polysciences）を使用して実施した。通常、HEK293 細胞を 2 mL の完全 DMEM 中で 1 mL あたり 2 × 105 細胞の細胞密度で 6 ウェル培養プレートに播種し、CO2 インキュベーターで 1 日間培養しました。 100μlのOpti-MEM（Life technology）で希釈したプラスミド溶液と、100μlのOpti-MEM中の4μlの1mg/mL PEI溶液を混合することにより、トランスフェクション溶液を混合した。トランスフェクトされた細胞をさらに１日間インキュベートした後、以下に記載するアッセイに供した。

ΔGαi 細胞は、図 1B に示す反復 CRISPR/Cas9 媒介突然変異誘発戦略によって取得されました。 GNAI1、GNAI2、GNAI3、GNAO、GNAZ、GNAT1、GNAT2 遺伝子をターゲットとする sgRNA コンストラクトは、CRISPR.MIT.EDU ウェブサイト (すでに閉鎖されています) を使用して設計され、SpCas9 媒介 DNA 切断部位 (DNA 切断部位の 3 bp 上流)プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列) には制限酵素認識部位が含まれます。ガイド RNA をコードするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し (FASMAC)、pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) ベクターの BbsI 部位に挿入しました (Feng Zhang、Broad Institute、Cambridge、MA からの贈り物; Addgene プラスミド No .48138）。ガイド RNA 配列が正しく挿入されていることは、サンガー法 (FASMAC) を使用した配列決定によって検証されました。 HEK293A 細胞を 6 ウェルプレートに播種し (2 mL の完全 DMEM 中に 1 mL あたり 1.0 × 105 細胞)、24 時間後に、リポフェクタミン 2000 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、遺伝子をコードする Gαi サブユニットを標的とする PX458 ベクターの組み合わせでトランスフェクトしました。 3日後、細胞を回収し、GFP陽性細胞の上位10〜20%を蛍光活性化セルソーター(SH800; SONY)で単離しました。単離された細胞は、クローン増殖のために 96 ウェルプレートに分配されました。クローンは、キャピラリー電気泳動システム (MultiNA、島津製作所) を使用した PCR および制限酵素消化によって、標的遺伝子の変異について分析されました。制限酵素耐性の PCR 産物は、ダイレクトシークエンシングまたは TA クローニングによってゲノム DNA の変化について評価されました。標的化が成功したことは、以下に記載するように、GPCR媒介cAMP阻害を評価することによって確認された。ガイド RNA をコードするオリゴヌクレオチド配列、sgRNA ターゲティング部位の増幅に使用される PCR プライマー、および PCR 産物の消化に使用される制限酵素を補足表 2 に示します。

HEK293 細胞からの全 RNA は、GenElute Mammalian Total RNA Miniprep キット (Sigma-Aldrich) を使用して調製されました。製造業者の指示に従って、High-Capacity cDNA RT キット (Applied Biosystems) を使用して、全 RNA を逆転写しました。リアルタイム定量的 PCR は TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio) を使用して実行され、ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) によってモニタリングされました。 RNA 発現データは GAPDH の発現に対して正規化されました。 PCR プライマー配列を補足表 3 に示します。

プラスミドのトランスフェクションは、1 μg (6 ウェルプレートのウェルあたり) Glo-22F cAMP バイオセンサーをコードする pCAGGS プラスミド (Genscript によるコドン最適化で合成された遺伝子)、200 ng の GPCR の混合物を使用して 6 ウェルプレートで実行されました。をコードするプラスミドと 100 ng の Gαi サブユニットをコードするプラスミド。 1 日間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞を 0.53 mM EDTA 含有 D-PBS で回収し、190 g で 5 分間遠心分離し、0.01% ウシ血清アルブミン (BSA、脂肪酸フリーおよびプロテアーゼフリーグレード、Serva) に懸濁しました。）およびハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む 5 mM HEPES（pH 7.4）。細胞を白色の９６ウェルプレートに播種し（ウェルあたり３０μｌ）、Ｄ－ルシフェリンカリウム溶液（ウェルあたり８ｍＭ溶液１０μｌ；富士フイルム和光純薬）をロードした。暗所、室温で２時間インキュベートした後、プレートの初期発光カウントを読み取った（ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＬ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）。細胞をリガンド単独（Gsアッセイ）またはリガンドと一緒に10μMフォルスコリン（富士フイルム和光純薬）で処理した（Giアッセイ）（ウェルあたり10μlの5×溶液）。反応速度測定では、プレートを 20 分間測定し、倍率変化値として表しました。化合物添加後16分から20分までの倍数変化発光シグナルを平均し、フォルスコリン処理条件における発光シグナルに対して正規化した。 Prism 9 ソフトウェア (GraphPad Prism) を使用して、cAMP シグナルを 4 パラメーターのシグモイド濃度応答曲線に当てはめ、そこから EC50 および Emax 値を取得しました。結合プロファイルの階層的クラスタリングは、Ward メソッドを使用して Python で実行されました。

TGFα 放出アッセイは、以前に記載されているように若干の変更を加えて実行されました 25。プラスミドトランスフェクションは、500 ng（6ウェルプレートのウェルあたり）AP-TGFαコードプラスミドと200 ng GPCRコードプラスミドの混合物を用いて6ウェルプレート内で実施した。 1日間の培養後、トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理によって回収し、190gで5分間の遠心分離によってペレット化し、5 mM HEPES (pH 7.4)含有HBSSで1回洗浄した。遠心分離後、細胞を 6 mL の HEPES 含有 HBSS に再懸濁しました。細胞懸濁液を96ウェル培養プレート（セルプレート）に90μl（以下、1ウェルあたり）の量で播種し、CO2インキュベーター内で30分間インキュベートした。細胞を GPCR リガンド (10 倍、5 mM HEPES (pH 7.4) および 0.01% (w/v) BSA を含む HBSS で希釈) で処理しました。細胞プレートを回転させた後、80 μl の馴化培地を空の 96 培地に移しました。 - ウェルプレート (馴化培地 (CM) プレート) AP 反応溶液 (10 mM p-nitrophenylphosphate (p-NPP)、120 mM Tris-HCl (pH 9.5)、40 mM NaCl、10 mM MgCl2) 合計 80 μl AP-TGFαを細胞プレートとCMプレートに分注し、室温で1時間インキュベートする前後に、マイクロプレートリーダー（SpectraMax 340 PC384、Molecular Devices）を使用してプレートの405 nmでの吸光度を測定しました。放出は、リガンド誘導性のAP-TGFα放出シグナルから自発的AP-TGFα放出シグナルを差し引くことによって計算した。

フローサイトメトリー分析は前述のように実行されました3。プラスミドのトランスフェクションを、1 μg (6 ウェルプレートのウェルあたり) の Glo-22F、100 ng の Gαi1、および N 末端ヘマグルチニンシグナル配列を持つ MOR をコードするさまざまな量のプラスミドを用いて 6 ウェルプレートで実行しました。 FLAG エピトープタグと 15 アミノ酸の柔軟なリンカーによって。トランスフェクトされた細胞を、300μlの0.53mM EDTA含有D-PBSを添加し、続いて300μlの5mM HEPES(pH7.4)含有HBSSを添加することによって回収した。細胞懸濁液を 96 ウェル V 底プレートに分注しました (ウェルあたり 200 μl、サンプルあたり 2 ウェル)。 700gで1分間遠心分離した後、細胞をD-PBSで1回洗浄し、ペレット化した。細胞ペレットを２％ヤギ血清および２ｍＭＥＤＴＡ含有Ｄ－ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液；ウェル当たり１００μｌ）に懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。 700gで1分間遠心分離した後、細胞を氷上で30分間、抗FLAGエピトープタグモノクローナル抗体（クローン1E6、富士フイルム和光純薬、ブロッキングバッファー中10μg/mL、ウェル当たり50μl）で染色した。 D-PBS ですすいだ後、細胞を Alexa Fluor 488 と結合したヤギ抗マウス IgG 二次抗体 (Thermo Fisher Scientific、ブロッキングバッファーで 10 μg/mL 希釈、ウェルあたり 25 μl) で氷上で 15 分間標識しました。。細胞をD-PBSで1回洗浄し、100μlの2mM EDTA含有D-PBSに再懸濁し、40μmフィルターで濾過した。蛍光標識された細胞 (サンプルあたり約 20,000 個の細胞) を EC800 フローサイトメーター (Sony) で分析しました。 Alexa Fluor 488 に由来する蛍光シグナルは FL1 チャネルに記録され、フローサイトメトリーデータは FlowJo ソフトウェア (FlowJo) によって分析されました。記録された蛍光シグナルをすべて使用し、平均蛍光強度 (MFI) を計算しました。

プラスミドトランスフェクションは、LgBiT と miniGi1 間のリンカー長が元の構築物から 15 アミノ酸に延長された 500 ng NES-LgBiT-miniGi1 コードプラスミドと、さまざまな量のC末端にSmBiT融合MORプラスミド（N末端にヘマグルチニンシグナル配列があり、FLAGエピトープタグと15アミノ酸の柔軟なリンカーが続く）。 1日間の培養後、トランスフェクトされた細胞を1 mLの0.53 mM EDTA含有D-PBSで回収し、続いて2 mLのHEPES含有HBSSを添加した。細胞を１９０ｇで５分間遠心分離し、０．０１％ＢＳＡおよび５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有するＨＢＳＳ（アッセイ緩衝液）２ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を96ウェル培養白色プレート（Greiner Bio-One）に80μl（以下、ウェルあたり）の量で播種し、アッセイバッファーで希釈した50μMセレンテラジン（Carbosynth）溶液20μlをロードした。室温でセレンテラジンと2時間インキュベートした後、MetEnk（6μM、アッセイバッファーで希釈）を手動で細胞に添加しました（20μl）。リガンド添加後 40 秒ごとに発光シグナルを測定し、10 ～ 15 分の平均発光値をプロットしました。

GloSensor cAMP アッセイおよび TGFα シェディングアッセイでは、3 つの独立した実験をそれぞれ 2 回および 3 回実行しました。定量的 RT-PCR 分析では、3 つの独立した実験を二重に実行しました。記号とエラーバーは、それぞれ独立した実験の示された数の平均値と SEM を表します。濃度反応曲線は、絶対値 2 未満のヒルスロープの制約を伴う Prism 9 の非線形回帰: 可変スロープ (4 つのパラメーター) によってすべてのデータにフィッティングされました。多重比較分析では、二元配置分散分析によって統計的有意性をテストし、続いて Prism 9 を使用して示された事後テストを実行しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

研究で生成または分析されたすべてのデータは補足データ 1 に提供されます。

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クラスタリング分析にご協力いただいた東北大学の倉本立樹氏に感謝いたします。原稿編集には斉藤彩希ら井上研究室のメンバーが協力。 miniGi1 構築については、東京大学の小林一弘氏と濡木修氏が担当しました。 AI は、日本学術振興会 (JSPS) の科研費 21H04791、21H05113、JPJSBP120213501、および JPJSBP120218801 によって資金提供されました。科学技術振興機構（JST）のFORESTプログラムJPMJFR215TおよびJSTムーンショット研究開発プログラムJPMJMS2023。日本医療研究開発機構 (AMED) の BINDS JP22ama121038; 武田科学財団、公益財団法人上原記念財団 YO君がJSPS科研費20J20669を受賞しました。

東北大学大学院薬学研究科分子細胞生化学、〒980-8578 宮城県仙台市

Yuki Ono, Kouki Kawakami, Gaku Nakamura, Satoru Ishida & Asuka Inoue

〒113-0033 東京都文京区東京大学大学院薬学系研究科保健化学専攻

青木順賢

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概念化: YO と AI。調査：YO、GN、KK、SI。執筆: YO、KK、AI、共著者全員からのフィードバック。資金調達：YO、JA、AI。監修：JA・AI

井上明日香さんへの対応です。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献した Bryan Roth 氏、Ajith Karunarathne 氏、およびもう 1 人の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Joao Valente。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

小野裕也、川上和也、中村剛他 Gαi ノックアウト HEK293 細胞の生成は、GPCR の Gαi 共役の多様性を明らかにします。 Commun Biol 6、112 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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受信日: 2022 年 8 月 3 日

受理日: 2023 年 1 月 11 日

公開日: 2023 年 1 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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