ペスト菌のゲノムから4000年前の英国のペストが明らかに

Nature Communications volume 14、記事番号: 2930 (2023) この記事を引用

8835 アクセス

839 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ペストの原因物質であるペスト菌の絶滅した系統は、現在（BP）の 5000 年から 2500 年前にユーラシアの数人の個体で確認されています。そのうちの1つは、「LNBA系統」（新石器時代後期および青銅器時代）と呼ばれ、ユーラシア草原から拡大した人類集団とともにヨーロッパに広がったと示唆されている。今回我々は、英国からの3つのペスト菌ゲノムを配列決定することによって、LNBAペストがヨーロッパの北西周辺に広がったことを示し、すべての年代はおよそカロリーBP4000年前に遡る。 2人はサマセット州ウォーレンのチャーターハウスでの異常な集団埋葬で、1人はカンブリア州レーベンズのリング・ケルン記念碑の下での単独埋葬であった。私たちの知る限り、これは現在までに記録されている英国における LNBA 疫病の最も初期の証拠を表しています。 3つの英国のペスト菌ゲノムはすべて、推定上の病原性因子yapCを失った中央ヨーロッパの青銅器時代の個体で以前に観察された亜系統に属している。この亜系統は後に、約 3200 cal BP の東アジアで発見されます。この病気の重症度は現時点では不明ですが、数世紀以内に地理的に広範囲に分布することから、かなりの感染力があることが示唆されています。

エルシニア・ペスティスは、感染したノミ媒介動物の咬傷を介して腺ペストまたは敗血症ペストを引き起こしたり、人から人への接触による飛沫を介して肺ペストを引き起こしたりする人獣共通感染症細菌です。古代の DNA 分析により、ペスト菌がユスティニアスのペスト 1,2,3 や黒死病 4,5 などの歴史的な伝染病の原因物質であることが特定されただけでなく、先史時代にペスト菌が流行していたこれまで知られていなかった証拠も特定されました。新石器時代後期および青銅器時代前期（LNBA）のペストは、約 4700 ～ 2800 BP（現在より前）の期間にユーラシア全土で発見されています6、7、8、9、10、11、12。最も頻繁に観察される LNBA 系統には、ymt 病原性因子 (LNBA ymt-) が欠如しています 11,13。 ymt 遺伝子 (LNBA ymt+) を持つ系統の既知の証拠は、ロシアのサマラの約 3,800 BP 歳の個体 (RT5) とアラバの約 3,300 BP 歳の個体 (I2470) で発見されました。、スペイン11．

LNBA の系統は、ユーラシア草原を起源とする人類の拡大によって、約 4800 年前に中央および西ヨーロッパに持ち込まれた可能性が高く 6,14,15、これらの系統が特定の後期新石器時代ヨーロッパ社会の衰退に寄与したと仮説されています 6,7。しかし、LNBA ペストがヨーロッパ全土にどこまで広がったかは不明であり、LNBA ymt 系統の最西端の発見は、現在のドイツ南部～3400 BP で以前に確認されています11。ベルビーカー文化の拡大に伴う人間の移動により、草原由来の祖先がイギリスに導入され、約 4400 年前からヨーロッパ大陸とのつながりが強化されました 16。これにより、北西ヨーロッパの青銅器時代の集団もペスト菌の LNBA 系統の影響を受けた可能性が開かれました。これは今まで直接観察されていませんが。

今回我々は、英国の異なる地域の2つの場所からのLNBAペスト菌感染の証拠を示しており、この系統はユーラシア草原への祖先をたどる集団の西方への拡大後に英国全土に広がった可能性があることを示唆している。英国で発見されたLNBAペスト菌系統は、推定上の病原性因子yapCを含むゲノムの大幅な喪失を経験したクレードに属している。

私たちは、英国における LNBA ペスト菌の存在を検査するために、英国初期青銅器時代の 2 つの場所、チャーターハウスウォーレンとレベンズパークから 34 人の個体をサンプリングしました。私たちは古代の DNA クリーンルーム条件で歯をサンプリングし、二重インデックス付き一本鎖 DNA ライブラリーを調製し、それぞれ 180 万から 730 万のペアエンドリードでスクリーニングしました (方法)。我々は、Kraken 217でメタゲノム解析を実施し、近縁種のYersinia pseudotuberculosisと比較して、Yersinia pestisに一致するk-merを大幅に過剰に持つ個体を特定した（方法）。この分析により、英国サマセットのチャーターハウスウォーレンファームから病原体 DNA についてスクリーニングされた 30 人のうち 2 人 (C10091/1233b および C10098/6265) が特定されました (文脈の詳細については「方法」を参照)。この遺跡は、自然の立坑内に一度の出来事で一緒に堆積された可能性が高い、分断された人間の遺体の大量埋葬群です。採取された 2 本の歯は、それぞれ 12 ± 3 歳と 10 ± 3 歳の子供から採取されました。 C10098 の歯 (6265/10 歳児) に関連する下顎骨は、直接放射性炭素年代測定により cal BP 4145 ～ 3910 cal BP と特定されました (信頼度 95.4%、OxA-37840: 3685 ± 30 BP、IntCal2019 を使用して OxCal v4.418 で校正) ）、以前に発表された、この集団からの人骨に関する 2 つの放射性炭素年代測定と一致しています20。もう一人の人物も同様の年代のものであると考えられます。

さらに、我々の分析では、英国カンブリア州レーベンズにあるレーベンズパークのリングケルン記念碑から回収された4人のうちの1人からペスト菌が確認された21,22（考古学的背景の詳細については「方法」を参照）。 1 つの完全な骸骨と 3 つの乱れた骸骨 (埋葬物 1、2、3、および 4) が記念碑から回収され、すべては直接 1960 年頃のものと特定されました。カロリー血圧 4300 ～ 3700。我々は、埋葬2（C10928）の歯からペスト菌を検出した。埋葬2（C10928）は、板張りの墓（おそらく木の棺）からしゃがんだ状態でビーカー陶器の破片とともに発見された35〜45歳の女性である。この骨格は、直接的には 4065 ～ 3780 cal BP (信頼度 95.4%、GU-51281: 3602 ± 33 BP22) と年代測定されています。この放射性炭素年代をチャーターハウス C10098 から得たものと比較すると、これら 2 人がほぼ同時代の人物であった可能性を否定できないことが示唆されます (χ2 検定、df = 1、T = 2.746 (5% 3.841))。

複数の場所からのこれらの結果は、ペスト菌が青銅器時代に英国に広がったことを示しています（図1A）が、ペスト菌の発生頻度は依然として不明であり、2つの場所で観察された頻度よりも低い可能性があることに注意してください。考古学的遺跡からペスト菌が検出される偽陰性率は不明ですが、おそらく高い 23 ため、現場の他の個体が感染した可能性を排除することはできません。

TVMe + ASC 置換モデルを使用して 1000 のブートストラップ複製を使用して IQ-TREE v.1.6.1229 で構築された最尤系統樹。これには、フィルタリング基準 (方法) および 2 つのチャーターハウスに合格した以前に公開された LNBA ゲノム (補足表 1) が含まれます。この研究からのウォーレンゲノム。系統発生には、1.ORI CO92 (NC_003143.1) 参照ゲノムも含まれており、IP32881 Yersinia pseudotuberculosis (図には含まれていません) がルーツとなります。数字は、そのノードをサポートするブートストラップレプリケートの割合を示します。オレンジ色の枝は LNBA ymt- 系統を示し (紫色の先端はこの研究からの個体を示し、オレンジ色の先端は LNBA ymt- 系統に属する公開されたゲノムを示します)、青緑色の枝と先端は LNBA ymt+ 系統を示します。灰色の先端ノードは新石器時代の系統を示します。 B Levens Park (LP) のより低いカバレッジゲノム C10928 を含む最尤系統発生を示す系統図。Charterhouse Warren (CW) 株 C10091 および C10098 に近い位置にあります。 C (C10091 を除く A) に含まれるペスト菌ゲノムの年表。個人に関して直接行われた放射性炭素年代測定は、IntCal2018、19 を使用して OxCal v4.4.4 で校正されました (補足表 3)。 D LNBA 株と新石器時代のペスト菌株の分布を示す地図。紫色の点は、この研究で新たに配列決定されたゲノムを示します。紫とオレンジの点は LNBA ymt- ゲノムを表し、ymt 遺伝子が存在しないことを示し、青緑色の点は LNBA ymt+ ゲノム (ymt が存在する) を表します。灰色の点は、Yersinia pestisの新石器時代の株を示しており、これもymt病原性遺伝子を欠いています。「maps」パッケージとggplot2を使用してRで作成されたマップ。

Illumina NovaSeq プラットフォームを使用して、Charterhouse Warren の個人 C10098 および C10091 からそれぞれ約 7 億 6,800 万リードペアと約 3 億 2,200 万リードペアのダイレクトショットガンシーケンスデータを生成しました (表 1)。 length24 (メソッド)。 Levens Park の個体 (C10928) はショットガンシーケンスには適していませんでしたが、この個体と他の 2 個体のライブラリーは、ペスト菌 RNA ベイト (ダイセル) を使用した溶液中標的濃縮アプローチによる 2 ラウンドのハイブリダイゼーション捕捉を受けました。アーバーバイオサイエンス）。ダイレクトショットガンシーケンスとターゲット濃縮実験からのデータを統合すると、MQ1 のマッピング品質でフィルター処理した場合、C10091、C10098、および C10928 のペスト菌ゲノムがそれぞれ平均 8.4 倍、6.1 倍、および 3.3 倍カバーされました (表 1)。 3つのゲノムすべてが信頼性の証拠を示しました：25の死後損傷、参照ゲノムまでの編集距離の関数として観察された配列の数の減少、単峰性の断片長分布、およびゲノム全体にわたる比較的均一な範囲の広さ（補足図1）および図2A）。

我々は、この研究と以前に発表されたペスト菌新石器時代およびLNBAゲノム6、7、8、9、10、11、12、26（補足表1）のゲノムを現代のペスト菌ゲノム1.ORI CO92（NC_003143.1）と整列させた。 )27 を使用し、同様にエルシニア偽結核菌株 IP3288128 をアラインメントしました (方法)。我々はゲノムのサブセットを保持しました。これには、公開されているすべてのゲノムでサイトごとの最小配列深度が 3 であり、社内で配列決定された一本鎖ライブラリーのゲノムでは最小深さが 5 であると仮定して、高度にコールされたサイトが含まれていました（方法）。 IQ-TREE29 で系統推論を実行し、1000 回のブートストラップ反復で不確実性を評価し、FigTree で Y. pseudotuberculosis の系統発生を根付かせました。私たちの最終的な系統発生は、27 の古代に公開されたゲノムと、この研究からのチャーターハウスウォーレン個体 (C10091 と C10098) の両方で構成されました。我々は、再構築された系統発生において、チャーターハウスウォーレンエルシニアペスティスのゲノムが、より広範な LNBA ymtclade に含まれることを発見しました。 LNBA ymt-ゲノムの非対称分岐群では、年代学に従って大まかにグループ化されています11。英国のゲノムはチェコ共和国のゲノム (HOP001 および HOP004) に由来しており、その年代は cal BP 〜 4,300 cal BP および cal BP 〜 4,250 cal BP であることがわかりました。しかし、これはロシアのゲノムの基礎であり、その年代はおよそ cal BP (KLZ001) 11 です。実際、以前に公開されたゲノムのトポロジーは、以前に再構成された系統発生と一致します。また、レベンスパーク由来の低カバレッジゲノム（C10928）を、チャーターハウスウォーレンゲノムと隣接分岐群からの高カバレッジゲノムを含む縮小系統に配置しました（方法）（図1B）。チャーターハウス・ウォーレンのもの。

2 つの Charterhouse Warren ゲノムは、最小配列深さ 5 の 939,710 部位のうち 2 つのトランスバージョンミスマッチを示します (ミスマッチ率 0.0002%)。これらはどちらも C10091 ゲノムの明らかな変化によるもので、CO92 (NC_003143.1) 参照ゲノムと並べると、位置 2227793 と 2227794 で互いに隣接して位置します。 NCBI ヌクレオチドアーカイブの BlastN 検索では、すべての配列が最上位一致として偽結核エルシニアとペスト菌を持っていることが判明しましたが、観察されたトランスバージョンは挿入に隣接しており (さらに読み取られた 1 つの配列には欠失が含まれていました)、したがって、それらは偽のものである可能性があるようです。データベースで特徴付けられていないソースからのアライメント（補足図2、補足表230）。

カバー率の高いCharterhouse Warrenゲノム全体の配列深さを評価することにより、主要な欠失を検索しました（方法）。 1000 bp を超える新たな欠失は確認されませんでしたが、以前に同定された「イベント 1」（LNBA 株で最も古い欠失）は 36 kb 領域の喪失をもたらし、以前に配列決定された複数の個体で観察されました 8,11 も観察されています。チャーターハウスウォーレンとリーベンスパークの両方のゲノムに含まれています。この領域の欠失により、yapC 病原性遺伝子が失われ、この遺伝子は in vitro で培養細胞の接着を媒介することが示されており、感染時のペスト菌の定着能力を高めた可能性があります 31。

英国ペスト菌ゲノムの系統発生的配置とすべて一致する他の機能要素の有無を観察します。我々は、公開されているすべての新石器時代および LNBA ゲノムには存在しない糸状プロファージが存在しないことを確認しました。このプロファージは、今日では主に 1.ORI 株で同定されています 32。英国ペスト菌プラスミド上で以前に報告された病原性因子の有無はすべて、以前に発表された LNBA ymt-プラスミドと一致します (図 2B)。ノミ毒性の増加に関連する UreD 33、バイオフィルム形成の下方制御機構に関与する pde-2 34、およびその不活化が免疫侵入に関連する flhD 35 はすべて、チャーターハウスウォーレンゲノムにおいて機能の損失がないことと一致する変異を示します（方法)9.

A CO92 Yersinia pestis 染色体およびプラスミド pMT1、pCD1、および pPCP1 にわたるカバー率 (MQ30) の Circos プロット。青色は C10091、オレンジ色は C10098、ピンク色は C10928 を表します。染色体については 500 bp ウィンドウ、プラスミド pMT1 および pCD1 については 100 bp ウィンドウ、および pPCP1 については 10 bp ウィンドウを使用して、平均深さを計算しました。さらに、以前の研究と同様に、pPCP1 プラスミド (*) 上の 3000 ～ 4200 bp の領域を手動でマスクしました 59。 B ペスト菌の染色体およびプラスミド pCD1、pMT1、および pPCP1 にわたる正規化された適用範囲の深さによって評価された病原性関連遺伝子の推定有無のヒートマップ。紫色は 100% 存在、オレンジ色 (中間点) は 50% 存在、黄色は存在します。存在率が 0% である (方法)。

私たちの結果は、LNBA ymt-Yersinia pestis 系統が青銅器時代のヨーロッパ大陸に限定されず、西の英国まで広がっていたことを明らかにしました。われわれは、英国のペスト菌ゲノムが、ユーラシア草原に遡る人類の拡大によって導入された可能性がある、現在のドイツの青銅器時代のゲノムと密接な親和性を持っていたことを示す。したがって、我々の結果は、以前に公開されたゲノムと合わせて、約 4700 ～ 2800 cal BP の期間にペスト菌の LNBA ymt 株が英国から東アジアに至るユーラシア全域に広がっていたことを示しています。それぞれイングランド北西部と南西部にあるリーベンズ・パークとチャーターハウス・ウォーレン遺跡の間の距離、および統計的に区別できない放射性炭素年代は、LNBA ymt-Yersinia pestis 株が英国全土にも広範囲に分布していることを示唆している可能性がある。

この研究に参加した個体は全員、ノミを介した感染に重要な役割を果たしていることが知られているymt病原性遺伝子を欠いている。 ymt 遺伝子を保有する既知の最古のペスト菌株は、ユーラシア草原西部のサマラ地域で発見されており、その起源は 3800 BP9 に遡ります。これは、英国からの我々の 2 つのペスト菌ゲノムと時期が近く、さらに広い地理的距離にわたる ymt 遺伝子の現代における頻度の違いについてのさらなる証拠を提供します。 ymt 遺伝子は、hms 遺伝子と並んで、ノミの中腸および前胃における細菌の生存と定着を可能にし、ノミを介した伝染を可能にします 36,37,38。しかし、研究では、ノミ媒介感染に完全な外因性潜伏期間を必要としない初期段階の感染モデルも示唆されています39。また、マウス、ヒト、クマネズミからの血液とは対照的に、ドブネズミの血液では、ymt 遺伝子がノミを介した感染においてそれほど重要な役割を果たしていないことも示唆されています40。

堆積物の規模と広範な外傷の証拠の点で、チャーターハウスウォーレンは、青銅器時代初期のヨーロッパの文脈では稀な遺跡です41。チャーターハウスの集団埋葬に参加した人々が、非規範的な形式の葬儀治療を受けていたことは明らかであり、この異常な治療は、ペストの局地的流行に対する特別な対応であった可能性があると示唆するのは自然なことかもしれない。黒死病の流行に反応して中世ヨーロッパ各地に出現した集団墓地42。しかし、チャーターハウスのウォーレン集団（RJS、T. FC.、JO、クリストフ・スノック、フィオナ・ブロック、LL、TA、ドン・ウォーカー、準備中）の中に致命的な外傷があったという証拠から、この集団埋葬が致死性の感染爆発によるものである可能性は低い。ペストの。それにも関わらず、内因性微生物 DNA の保存状態の悪さや病原体負荷の変動などの要因により、偽陰性の可能性があり、古代の病原体の検出をより困難にしているため、このサイトの残りの 28 人の間でペストの罹患率が高い可能性を完全に排除することはできません 23。このことから、この病気とこれらの人々に対する暴力的治療との間に何らかの関連があったのではないかという疑問が生じますが、現時点ではこれに答えることはできません。 2つの子供の下顎骨のうち少なくとも1つは生前外傷の兆候を示しているが、遺体の関節が切断された状態は、骨格の残りの部分への潜在的な外傷を評価できないことを意味する。 2人の子供にペスト菌のDNAが存在することは、何らかの外傷が加えられたときに彼らが病気になったか、あるいはペストによる死後に何らかの外傷が加えられたことを示唆している。後者のシナリオを完全に無視することはできませんが、集団全体で観察された生前外傷の割合を考慮すると、ありそうもないことであり、ほとんどまたはすべての個人が特定の暴力的出来事の間に殺害されたことを示唆しています。対照的に、レーベンズパークのリングケルンからの埋葬 2 は、この時代のより規範的な葬儀を表しています22。これらの疑問に答え、英国およびその他の国におけるペスト菌の伝播動態と機能進化をより深く理解するには、さらなる高解像度サンプリングが必要となるだろう。

すべての放射性炭素年代は、IntCal20 検量線を使用して OxCal 4.4 で校正されました 18,19。貯留層の影響を補正する必要があるような、海産または淡水の食物の検出可能な投入量に関する安定した炭素および窒素同位体の証拠はありません。

チャーターハウスウォーレンは、サマセット州メンディップヒルズの石灰岩にある自然の立坑です。 1970年代の最初の発掘は、当時この場所からの考古学的な遺跡が知られていなかったため、立坑が洞窟システムにつながっているかどうかを判断するために開始されました。掘削機は、関節が切断された状態の人骨と動物の骨の存在に気づき、その一部には切り傷やげっ歯類のかじりが見られました43。 aDNAを採取するために採取された人間の遺体の集合体は、約1500メートルの別個の層で発見された。深さ 15 m、動物の遺骸とビーカー容器の破片を含む少数の人工遺物。少なくとも40人の男性、女性、子供が断片的で分断された遺体で表現されている。文化的にも年代的にも、この集合体はビーカー時代後期/青銅器時代前期に遡ります。カロリー血圧4150～3950。これはこの時代の非規範的な埋葬状況であり、葬儀記念碑や墓地に関連する単一の関節式埋葬が主流です。かなりの割合の骨で見つかった変化は、すべてではないにしても、これらの個体の多くが致命的な生前外傷とその後の処理を受け、その後、単一の出来事である可能性が高く、関節が切断された骨が骨幹に沈着したことを示唆しています。放射性炭素年代測定の集合体の分析とモデル化が進行中です。青銅器時代の英国では分断された遺骨が時々発見されるが、チャーターハウス・ウォーレンでの堆積の規模は英国の文脈では独特であり、非常に珍しい出来事が表されていることが示唆されている。多数の頭蓋骨に対する鈍器による生前の外傷の証拠と切断の証拠は、これが極度の暴力のエピソードに関連している可能性があることを示唆しています。

英国カンブリア州レーベンズにあるレーベンズ・パークのリング・ケルンは、低い縁石の塚とその下にさらに輪状の岩や壁のような構造物がある構成で、1968 年から 1971 年にかけて David Sturdy によって発掘されました21。レーベンス郷土史グループのメンバーによる既存のアーカイブ資料の調査により、発掘調査が最近再評価され、記念碑とその目的がより詳細に理解されるようになりました22。ここではサイトの一般的な説明を提供しますが、関連する不確実性の詳細については、Clare et al.22 を参照してください。 4 つの人骨 (埋葬 1、2、3、4) が記念碑から回収され、埋葬活動の 2 つの別々の段階を表しています。埋葬4では、25〜45歳の男性が介助者なしでしゃがんで埋葬され、大きな岩で覆われていましたが、関連する遺物はありませんでした。この骨格は放射性炭素年代測定により、カロリー BP 4229-3976 年 (信頼度 95%、3731 ± 34 BP、GU-51283) と特定されており、他の 3 つの骨格の年代よりも大幅に古い (OxCal 4.4 の R_Combine χ2 テスト: df = 3、T = 11.2 (5%、11.8))18,19。埋葬物 1、2、および 3 は、記念碑内の隣接するより大きな建造物から回収されました。彼らの放射性炭素年代は統計的に区別できず、ほぼ同時期、または互いに数十年以内に死亡した可能性があることを示唆しています (OxCal 4.4 での R_Combine χ2 検定: df = 2、T = 0.7 (5%、6.0));18,19埋葬2は、新しい建物の中心に位置しているため、この段階での最初の埋葬であると考えられており、板で裏打ちされた墓からしゃがんだ状態で回収された35〜45歳の女性でした（おそらく、木製の棺）とビーカー陶器の破片が付属していました。この骨格は、直接的には 4065 ～ 3780 cal BP (95% の信頼度、3602 ± 33 BP、GU-51281) と年代測定されています。埋葬 1、17 ～ 35 歳の女性、推定血圧値 4,080 ～ 3,840 血圧、95% 信頼度、3,626 ± 33 BP、GU-51280)、および埋葬 3、推定成人女性、推定推定血圧値 3,982 ～ 3,879 血圧 (信頼度 95%、血圧 3587 ± 33、GU-51282) はケアンマトリックスから回収されましたが、それらの元の特徴と関連性は不明です。埋葬者 1、3、4 のストロンチウムと酸素の安定同位体分析は、埋葬者 2 と同様に英国の他の地域での起源とも一致しますが、結果は埋葬者 1、3、4 が地元で成長したものであることと一致しています。

サンプルはフランシスクリック研究所の専用クリーンルーム施設で処理されました。 EV410-230 EMAX Evolution Dentistry ドリルを使用して歯の表面を洗浄し、セメント質と象牙質の複数の部分の両方をサンプリングしたところ、象牙質から 7 ～ 25 mg の粉末が得られました。次に、象牙質粉末を 300 μl (<10 mg の粉末)、600 μl (10 ～ 25 mg) または 1000 μl (>25 mg の粉末) の溶解バッファー (0.5 EDTA pH 8.0、0.05% Tween-20、0.25) で溶解しました。 mg/ml プロテイナーゼ K44) を使用し、37 °C で一晩インキュベートしました。ライセートを卓上遠心分離機で最大速度 16,400 × g (13,200 rpm) で 2 分間遠心分離し、ライセート 140 μl を Agilent Bravo Workstation45 での自動抽出のために FluidX チューブに移しました。抽出物は一本鎖 DNA ライブラリーに変換され 24、その後二重インデックスが付けられ 46、Illumina HiSeq4000 または NextSeq500 プラットフォームでペアエンドシーケンシングが行われ、初期スクリーニングではサンプルあたり 180 万から 730 万のリードペアが得られました。すべてのサンプルは、ネガティブなライセートおよび抽出コントロール、ならびにポジティブおよびネガティブなライブラリーコントロールと一緒に処理されました。

最初の病原体検出に続いて、myBaits カスタム RNA seq v5.1 (2021 年 3 月) 高感度プロトコル 47 に従って、myBaits Arbor Biosciences によって事前設計されたペスト菌餌を使用して、ライブラリーを標的濃縮に進めました。初期ライブラリー 7 μl を 55 °C で 23 時間の一晩インキュベーションおよび 20 PCR サイクルによる 2 ラウンドのハイブリダイゼーションに使用し、続いて 1 サイクル PCR および MinElute Purification (Qiagen) クリーンアップを使用してヘテロ二本鎖を除去しました。 Illumina MiSeq および NovaSeq プラットフォーム上の 2 × 100 ペアエンド読み取り構成で各ライブラリーをシーケンスしました (表 1)。

Gansauge et al.24 のように、大規模なダイレクトショットガンシーケンスの前に、35 bp より短いフラグメントと 150 bp より長いフラグメントがライブラリから削除されました。具体的には、最初のライブラリー 100 ng をビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを使用して非ビオチン化鎖を単離し、一本鎖ライブラリーを取得しました。次に、これらのサンプル (他の 3 サンプルとプール) を 35 bp および 150 bp のインサートマーカーとともに変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、一晩インキュベートした後、目的の配列長内のフラグメントを物理的に切り出し、ゲルから溶出しました。得られたサイズ選択されたライブラリーをさらに増幅し、Illumina NovaSeq で配列決定しました (表 1)。

サンプルは、nf-core/eager v2 パイプラインを介して処理されました48。まず、アダプターが削除され、ペアエンドリードがマージされ、AdapterRemoval v249 を –trimns –trimqualities –collapse –minadapteroverlap 1 および –preserve5p で使用して、品質 20 未満の塩基がトリミングされました。最小長 35 bp のマージされたリードは、次のパラメーター「-l 16500 -n 0.01」51,52 を使用して、Burrows-Wheeler Aligner (BWA-0.7.17 aln)50 で hs37d5 ヒト参照ゲノムにマッピングされました。

われわれは、Kraken 217を使用してヒトゲノムとうまくアライメントできなかった配列を分析し、偽結核菌と比較してペスト菌に対して観察されたk-mer（配列一致）の数を評価することによって、ペスト菌に推定陽性である個人を特定した。続いて、これらのライブラリーを、BWA aln50 パラメーター「-l」を使用して、CO92 ペスト菌参照ゲノム (NC_003143.1) および CO92 プラスミド、pMT1 (NC_003134.1)、pCD1 (NC_003131.1)、および pPCP1 (NC_003132.1) とアラインメントしました。 16500 -n 0.01 -o 2"。重複は、開始位置と長さが同じシーケンスのセットから最初のシーケンスのみを保持することによって削除されました (https://github.com/pontussk/samremovedup)。我々は、以下の基準を用いて配列の最終セットの信頼性を評価した:25、配列の数が参照ゲノムからの編集距離と負の相関がある死後損傷の観察、およびDamageProfiler53による単峰性の断片長分布。さらに、SAMTools v1.3.1 Depth54 を使用して、参照ゲノム全体にわたる均一な範囲のカバレッジを確認しました。これらの認証基準に合格したライブラリのスクリーニングは、さらなるショットガンのシーケンスとターゲットの強化のために進められました。最終的な BAM ファイルについては、samtools merge を使用してショットガンファイルとターゲットエンリッチド BAM ファイルをマージした結果、最小マッピング品質 q1 でフィルタリングした場合、C10091、C10098、および C10928 の最終カバレッジがそれぞれ 8.4x、6.1x、および 3.3x になりました ( MQ1) (表 1、図 2A、補足図 1)。

我々は、ペスト菌染色体、pCD1、pMT1、および pPCP1 プラスミド上で以前に同定された病原性遺伝子 11 を使用し、BEDTools v2.29.255 でこれらの遺伝子のカバー率を分析しました (図 2A)。次に、R の ggplot256 パッケージを使用して、少なくとも 1 つの配列によってカバーされる各病原性遺伝子の位置のパーセンテージの色付きヒートマップを作成しました。さらに、BEDTools v2.29.255 genomecov を使用してゲノム全体の欠損を評価し、Charterhouse の 2 人の個体で 1 kb を超える領域を特定しました。ショットガンデータと比較した、事前に設計されたArbor RNA捕捉ベイト間のペスト菌染色体全体にわたるカバー率のいくつかの違いは、直接比較で観察できます。これはおそらく、ベイトセットで染色体の一部の部分が他の部分よりも優先的に捕捉されたためであると考えられます（補足図） 3）。しかし、これが重大な欠失や機能の喪失に関する結論につながる可能性があるという証拠は見当たりません。私たちは、ureD、pde-2、flhD 遺伝子を手動で検査して、これらの遺伝子に特異的なインデルと SNP の存在を特定し、それらがチャーターハウスウォーレンゲノムで機能するかどうかを評価しました9。しかし、C10928 のカバー率は低すぎて、これらのインデルを評価できませんでした。

samtools Cald54を使用してマッピングと塩基品質30のフィルタリングを行い、社内スクリプトを使用してヘテロ接合部位を削除した後、2つのCharterhouse Warrenゲノムを比較して、異なるベースフォールドカバレッジでトランスバージョンSNPを特定しました（補足図2、補足表2）。 (https://github.com/pontussk/mpileup_mismatch_pathogen.py)。

青銅器時代と新石器時代のペストのゲノムおよびエルシニア偽結核菌の IP32881 株からの以前に公開されたデータは、欧州ヌクレオチドアーカイブ (補足表 1) からダウンロードされ、上記で説明したこの研究で生成されたデータと同じパラメーター (バイオインフォマティクス処理) を使用して処理されました。重複の削除は例外で、パブリッシュされたデータのシングルエンドシーケンスを調整するために、長さに関係なく同じ開始位置を持つ重複を削除します。

重複リードを削除した後、社内スクリプト (https://github.com/pontussk/mpileup2consensus.py) を使用して、基本品質スコアが Q30 のホモ接合サイトのみを保持し、ヘテロ接合サイトと小さい (より短い) サイトを除外しました。 samtools Cald54 を使用した場合、挿入または削除、最大編集距離は 90% です。次に、すべてのサイトをフィルタリングして、最小塩基カバレッジが 3 倍のサイトのみを保持し、公開されているすべてのゲノムのコンセンサス配列と、Charterhouse Warren ゲノムの 5 倍のカバレッジを取得しました。

次に、コンセンサス配列をフィルタリングして、系統発生への入力に使用される配列セット内で多型部位のみを保持し、すべての遷移を除去して古代 DNA 配列におけるシトシン脱アミノ化の影響を除去しました。主な系統発生 (図 1A) では、ゲノム全体で 70% 以上が欠損している個体を除外し、残りの個体の 20% 以上で欠損している部位を削除しました。その結果、IQ-TREE に転送された 2,306 個の転換 SNP が得られました。 v.1.6.1229。 IQ-TREE57のModelFinderを使用してモデルテストを実装しました。これにより、図1Aと図1Bの両方の系統に対するAkaike情報量基準に従って、TVMe + ASCが最適なモデルとして提案されました。図 1A の系統発生に対して 1000 回のブートストラップ反復を実装し、Yersinia pseudotuberculosis アウトグループ (IP32881) を使用して FigTree58 の最尤系統発生をルート化しました (図 1A の LBNA クレードの可視性を高めるために、アウトグループは図には示されていません) ）。

対象範囲が狭いため、別の系統推論を使用して、Levens Park ゲノム C10928 の位置を特定しました。ここでは、単系統の Charterhouse Warren (C10091 および C10098) グループにトポロジー的に近い LNBA 株のフィルタリングされたコンセンサス配列を取得し、少なくとも 70 個のトランスバージョンのみと存在する部位を維持しながら、最小塩基カバレッジ 3 までフィルタリングしました。ゲノムの % (ゲノム全体の欠損に関係なく)。これにより、100 個のブートストラップ複製を含む TVMe+ASC モデルを使用して、104 個の SNP が IQ-TREE に転送されました。最尤系統発生は、図 1A に基づいて FigTree58 にルートされ、図 1B の系統図に変換されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された配列データは、EMBL-EBI の European Nucleotide Archive (ENA) に受託番号 PRJEB61230 で寄託されています。

この研究で使用されたコードは、https://github.com/pontussk/ で入手できます。

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フランシス・クリック研究所のバイオインフォマティクスおよび生物統計科学技術プラットフォームの高度シーケンシング施設とクリス・バリントン氏の技術サポートに感謝します。 P.S.K. Vallee Foundation、European Research Council (助成金番号 852558)、European Molecular Biology Organisation、Wellcome Trust (217223/Z/19/Z)、および Cancer Research UK からの Francis Crick Institute core Funding (FC001595) の支援を受けました。、英国医学研究評議会、ウェルカムトラスト。 MH は、Marie Skłodowska Curie Actions (助成金番号 844014) によって支援されました。チャーターハウスウォーレン人骨集合体の骨学的分析は英国アカデミー (SG163375) によって支援され、放射性炭素年代測定の資金は NERC の NEIF プログラム (NF/2018/1/3) を通じて RS に提供されました。アランスチュワードとレーベンズ郷土史グループに感謝します。このプロジェクトにおける彼らのコラボレーション。レーベンスリングケルンの考古学研究は、レーベンス郷土史グループ (TC、GC、IH、M. シンプソン、SR) への CWAAS 補助金によって支援されました。この研究は、ウェルカムトラスト (FC001595 および 217223/Z/19/Z) から全額または一部の資金提供を受けました。また、Gunnar Neumann と SPAAM コミュニティの支援とアドバイスに感謝いたします。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じた著者が承認した原稿バージョンに CC BY 公共著作権ライセンスを適用しています。

フランシス・クリック研究所が提供するオープンアクセス資金。

故人：スティーブン・リード。

古代ゲノミクス研究所、フランシス・クリック研究所、ロンドン、英国

プージャ・スワリ、アレクサンドル・ジラルデ、モニカ・ケリー、キリアキ・アナスタシアドゥ、イザベル・グロッケ、ジェシー・マッケイブ、ミア・ウィリアムズ、トム・デイビー、マリーナ・シルバ、マテヤ・ハイディニャク、アンダース・バーグストロム、トーマス・ブース、ポンタス・スコグランド

オックスフォード大学考古学大学院、オックスフォード、英国

リック・シュルティング & テレサ・フェルナンデス=クレスポ

独立学者、ウェルズ、イギリス

トニー・オーズリー

オックスフォード考古学、オスニー・ミード、オックスフォード、イギリス

ルイーズ・ロー

ヨーロッパ先史時代地中海研究所アフリカ-UMR 7269、国立科学研究センター、エクス・マルセイユ大学、マルセイユ、フランス

テレサ・フェルナンデス・クレスポ

バリャドリッド大学、先史学、考古学、社会人類学、歴史学科学および技術学科、バリャドリッド、スペイン

テレサ・フェルナンデス・クレスポ

考古学・新技術局、アルキクス、スペイン

ハビエル・オルドーニョ

ウェルズ＆メンディップ博物館、ウェルズ、イギリス

デビッド・ウォーカー

レーベンズ郷土史グループ、レーベンズ、カンブリア州、英国

トム・クレア、ジェフ・クック、マーク・シンプソン、スティーブン・リード

リバプール・ジョン・ムーアズ大学生物環境科学部、リバプール、英国

イアン・ホドキンソン

マックス・プランク進化人類学研究所、進化遺伝学部門および考古遺伝学部門、ライプツィヒ、ドイツ

マテヤ・ハイディニャク

イースト・アングリア大学生物科学部、ノーリッチ、英国

アンダース・バーグストロム

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概念化: P. スワリ、P. スコグランド。データキュレーション: P. Swali、AG 正式な分析: P. Swali。資金調達: RS、P. Skoglund。調査: P. Swali、RS、AG、MK、MW、JM、KA、IG、TD、M. Silva、MH、AB、TB、P. Skoglund。プロジェクト管理: P. Swali、RS、TB、P. Skoglund。リソース: RS、TA、LL、TFC、JO、DW、TC、GC、IH、M. シンプソン、SR 監督: P. スコグランド。視覚化: P. Swali、AG、KA 執筆—原案: P. Swali、P. Skoglund。執筆 - レビューおよび編集: P. Swali、RS、MK、KA、TFC、JO、MH、AB、TB、P. Skoglund。

Pooja Swali、Thomas Booth、または Pontus Skoglund との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Swali、P.、Schulting、R.、Gilardet、A. 他ペスト菌のゲノムから、4000年前の英国でのペストの発生が明らかになった。 Nat Commun 14、2930 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38393-w

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受信日: 2022 年 1 月 21 日

受理日: 2023 年 4 月 28 日

公開日: 2023 年 5 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38393-w

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